Vi presenterer en fluorogenic peptid cleavage analysen som tillater en rask screening av proteolytisk aktiviteten til proteaser på peptider som representerer området spalting av viral fusion peptider. Denne metoden kan også brukes på noen andre aminosyren motiv i en protein sekvens til å teste protease aktiviteten.
Innhyllet virus som coronaviruses eller influensa virus krever proteolytisk spalting av deres fusion protein kunne infisere vert cellen. Ofte virus viser celler og vev tropism og er tilpasset bestemte cellen eller vev proteaser. Videre kan disse virusene introdusere mutasjoner eller innsettinger i sine genom under replikering som kan påvirke cleavage, og dermed kan bidra til tilpasninger til en ny vert. Her presenterer vi en fluorogenic peptid cleavage analysen der en rask screening av peptider etterligne webområdet spalting av viral fusion proteiner. Teknikken er svært fleksibel og kan brukes til å undersøke proteolytisk aktiviteten til en enkelt protease på mange ulike underlag, og i tillegg gjør det også mulig utforskning av aktiviteten til flere proteaser på én eller flere peptid underlag. I denne studien brukte vi peptider mimicking cleavage nettstedet motiver av coronavirus spike protein. Vi testet menneskelige og camel avledet Midtøsten åndedretts Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) å demonstrere at enkelt- og dobbeltrom erstatninger i området cleavage kan endre aktiviteten til furin og dramatisk endre cleavage effektivitet. Vi har også brukt denne metoden i kombinasjon med bioinformatikk teste furin cleavage aktivitet av feline coronavirus spike proteiner fra ulike serotyper og stammer. Denne peptid-basert metode er mindre arbeid- og tid intensivt enn konvensjonelle metoder brukt for analyse av proteolytisk aktivitet for virus, og resultater kan oppnås en enkelt dag.
Viral blanding med verten celle membran er et viktig skritt i livssyklusen til innhyllet virus og forenkler oppføring i cellen og replikering av viruset. Virus har vanligvis en spesialisert protein eller proteiner som binder seg til reseptorer på cellemembranen vert og utløser virus-celle membran fusion1. Viral fusion proteiner er gruppert i tre hovedgrupper (I-III)1. Et antall viruser som er svært viktig for folkehelsen, som influensavirus (representerer en langvarig zoonotiske fremveksten fra fugler) og Midtøsten åndedretts syndrom-coronavirus (MERS-CoV) (som representerer en nylig zoonotiske fremvekst fra kameler), utnytte den såkalte klasse I fusion proteiner, som krever proteolytisk behandling av verten proteaser, å utøve sine fusogenic aktivitet2. Tilsvarende feline coronavirus (FCoV), som representerer en stor sykdom trussel for vill og innenlands kattene, har en klasse jeg fusion protein. Klasse I viral fusion proteiner er vanligvis synthesized som en uncleaved forløper, og generelt består av to domener som er ansvarlig for reseptor bindende og utløser hendelsen fusion henholdsvis. Hittil er influensa hemagglutinin (HA) best forstått fusion protein og flere studier har beskrevet sin mekanistisk rolle i verten celle oppføring og fusion3. I dette tilfellet forekommer spalting av fusion protein på en bestemt sekvens eller cleavage område i HA, og i kombinasjon med pH-avhengig conformational endringer, resulterer i eksponering av viral fusion peptid1,2.
Fusion peptid og foregående protease anerkjennelse sekvensen er avgjørende for virusets og vert tilpasningen av viruset. Endringer i protease anerkjennelse rekkefølge kan endre cleavage betydelig med potensielt dramatiske konsekvenser for viruset og vert4. På den ene siden kan oppheve cleavage og dermed eliminere livet syklus av viruset. Men på den annen side, en mutasjon kan øke substrat spesifisiteten for en gitt protease og/eller tillate en “ny” protease deler fusion protein. Deretter kan dette også utvide ved celler og vev tropism som observert, f.eks med influensa virus subtyper5,6. Lav vanligvis virusets fugleinfluensa (LPAI) virus og mest menneskelig influensavirus er begrenset til den mage eller respiratoriske skrift på grunn av den begrensede lokaliseringen av proteaser aktivere dem. Vanligvis innledes fusion peptid slik HA proteiner med en fire-amino acid sekvens som består av 1-2 ikke grunnleggende aminosyrer, som er anerkjent av trypsin som serine proteaser som trypsin, matriptase eller TMPRSS27, 8. Når viruset kjøper innsettinger eller mutasjoner som endrer cleavage området til en polybasic nettsted, kan furin å aktivere HA og forårsake mye mer alvorlige systemisk infeksjon6,9. Disse virusene kalles høy virusets fugleinfluensa-viruset (HPAI), preget av H5N1 stammer.
I motsetning til influensa HA har mange coronaviruses, for eksempel MERS-CoV, to distinkte cleavage områder innenfor deres spike protein. S1/S2 området skiller N-terminal reseptor bindende domene (S1) fra C-terminalen fusion domenet (S2), med en andre cleavage nettsted, kalt S2′, nedstrøms S1/S2 nettstedet på nærhet til fusion peptid10. Det ble foreslått at nettstedene er kløyvde sekvensielt, på S1/S2 etterfulgt av S2′. I motsetning til HA mest influensa viruset stammer, MERS-CoV S protein S1/S2 og S2′ nettsteder kan bli gjenkjent av proteaser av proprotein konvertasene (PC)-familien, som furin. Medlemmer av denne familien cleave på sammenkoblede grunnleggende rester motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Vanligvis kalles aminosyrer oppstrøms av cleavage området P1, P2, P3, etc. telle fra webområdet cleavage og aminosyrer nedstrøms er angitt som P1′, P2′, P3′, osv. 11. FCoV stammer kan enten ha en enkelt eller et dobbelt cleavage område. Som MERS-CoV, noen FCoV stammer har to cleavage områder (S1/S2 og S2 “) i deres S protein. Men er denne karakteristikken eksklusive serotype jeg FCoVs (nyeste A). Derimot medlemmer av serotype II (nyeste B) grupperingen bare har et enkelt cleavage nettsted (S2′)2,12. Flere proteaser er foreslått deler FCoV cleavage områder, inkludert furin, trypsin som proteaser og katepsin. Det har blitt foreslått at S protein av innstigning FCoV (også kjent som feline enteric coronavirus eller FECV) er sannsynlig å være kløyvde av furin i området S1/S2, og mutasjoner i dette området (i tillegg til S2 “) fører til endringer i protease krav. Disse mutasjonene har vært knyttet til endringer i tropism og virusets av disse virusene, slik at viruset bli systemisk og macrophage-tropic (også kjent som feline infeksjon peritonitis virus eller FIPV)13.
Virus naturlig presentere mutasjoner i deres genomer under hver replikering syklus og ofte nye subtyper og stammer av influensa, MERS-CoV og FCoV er beskrevet14,15,16. Som en del av en rask evaluering å vurdere folkehelsen trusselen av nye virus, er det viktig å undersøke endringer i webområdet cleavage og hvordan det påvirker omfanget av proteaser aktivere disse virusene. Her beskriver vi en peptid-baserte analysen der en svært rask vurdering av hvordan cleavage stedet endringer i MERS-CoV S protein påvirker substrat spesifisitet av en gitt protease og raskt skjermen ulike proteaser til å holde seg til en gitt eller flere sekvenser4. I et annet sett av eksperimenter brukte vi teknikken for å avgjøre furin cleavage aktiviteten over ulike FCoV serotyper og stammer.
Peptidene brukes i denne analysen er endret med fluorescens resonans energi overføring (bånd) paret, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus. Under analysen, MCA er glade og avgir lys energi som er slukket av DNP som paret er i nærheten av hverandre. Hvis spalting, men DNP er ikke kunne slukke utslipp lenger og det kan leses av fluorescens plate leseren. Endringene i fluorescensen måles under eksperimentet å bestemme peptid cleavage pris og beregne hastigheten som protease kløyver de spesifikke peptid (også kjent som Vmax)17.
Utforme peptidene, genet av respektive fusion protein må ha blitt sekvensert og/eller gjort tilgjengelig i en database. Metoden er imidlertid mindre arbeid-intens og kostbart enn konvensjonelle metoder som vanligvis krever kloning av fusion protein genet i uttrykket vektorer til å uttrykke det i pattedyrceller analysere cleavage. Fra begynnelse til slutt, kan dette ta flere dager opptil et par uker mens peptid analyser presenteres her kan gjøres innen en dag så snart peptider og proteaser er tilgjengelig. Oppsettet av analysen tar mellom 5 og 30 min hvor mange eksempler runtime i fluorescens plate leseren er 1 h. analyse av dataene kan ta opptil 2 timer igjen avhengig av utvalgsstørrelsen.
Her, valgte vi to eksempler å presentere analysen. I det første eksemplet presenterer vi data som sammenligner i furin-mediert spalting av menneskelige og kamel-avledet MERS-CoV, å vurdere potensialet i den kamel-avledet stammer av aktiveres hos mennesker hvis de krysser arter barrieren. I det andre eksemplet, vi brukt en fluorogenic peptid analysen for å bestemme furin-mediert spalting av S1/S2 og S2′ nettsteder eller S2 “siden av to serotype jeg og to serotype II FCoV stammer, henholdsvis. For disse eksperimentene brukte vi trypsin cleavage som en positiv.
Vi presenterer her en fluorogenic peptid analysen som gir en rask screening av protein sekvenser for deres proteolytisk spalting av proteaser. I vårt første eksempel valgte vi forskjellige cleavage nettstedet motiver av MERS-CoV spike (S) protein å illustrere ett program for denne analysen. Flere innhyllet virus som har klasse jeg fusion proteiner som MERS-CoV, SARS-CoV (alvorlig akutt åndedretts syndrom) og influensa er store problemer for folkehelsen og nye subtyper stadig utvikling som har et potensial til å krysse arter barrierer fra deres naturlige verter til mennesker1,15,16. Isolere virus og dyrke dem i laboratoriet kan ikke alltid være mulig eller krever spesielle laboratorier som ikke finnes i hver forskning anlegget. Derfor er det behov for metoder for å vurdere potensielle folkehelsen trusselen om nye virus som kan utføres under vanlige laboratorieforhold. I tillegg til virus målretting mennesker, noen dyr virus som FCoV har samme klasse I fusion proteiner, derfor dele lignende egenskaper enn sine menneskelige kolleger. Isolere disse virusene kan også være en utfordring, gjør bruk av innovative verktøy å studere dem nødvendig.
Et avgjørende skritt i livet syklus av ovennevnte virus er vert celleoppføring og fusion formidlet av proteolytisk behandling av respektive fusion protein av host proteaser1,2. En standard måte å undersøke denne delen av viral levetid er å klone fusion protein genet til et pattedyr uttrykk vektor, transfect pattedyrceller som tillater protein uttrykk, ruge eller co transfect med protease interesse, isolere den protein og utføre en western blot analyse. Denne metoden har flere begrensninger: tilgjengeligheten av viral DNA/RNA for kloning, kostnader for å syntetisere genet hvis ingen DNA eller RNA er tilgjengelig, tilgjengeligheten av et antistoff å oppdage fusion protein og dens cleavage produkter, og det kan ta opptil flere uker før hele undersøkelsen er utført. Det blir enda mer tid, penger og arbeidsintensiv hvis interesse for studien er å undersøke flere mutasjoner i spalting området fordi det krever området-rettet mutagenese. Fluorogenic peptid analysen beskriver vi her har ikke disse begrensningene. Peptidene rundt kan utformes basert på offentlig tilgjengelig sekvenser, det er flere leverandører som tilbyr et bredt spekter av rekombinant proteaser som er relevante for slike studier og analysen inkludert analyse kan utføres innen en enkelt dag.
I vårt eksempel, undersøkte vi furin-mediert spalting av S2′ protease anerkjennelse webområdet av MERS-CoV S protein avledet fra mennesker og kameler fra Egypt og Marokko. Både den menneskelige EMC/2012 og kamelen HKU205 S2′ nettsteder inneholder et typisk RXXR furin cleavage motiv. Men ifølge PiTou 2.0 cleavage scoring algoritme HKU205 S2 “nettstedet er ikke spådd til å bli kløyvde av furin, som vi eksperimentelt bekreftet19. Grunnen hvorfor HKU5 S2′ behandles ikke av furin kan være isoleucin i P1 “posisjon. Når vi testet to peptider som gjennomført den personlige mutasjoner i EMC/2012 S2′ sekvens, kunne vi bekrefte at isoleucin i P1′ hovedsakelig opphever cleavage mens alanin til serine substitusjon resultert i redusert cleavage. Mor213-S2 “området inneholder ikke en furin cleavage motiv og det var ikke overraskende å oppdage nesten noen cleavage. Vi også undersøkt hvordan furin innstiftet S1/S2 og S2′ protease anerkjennelse områder av FCoV S protein. Vi var i stand til å observere furin spalting av både FECV-peptider (FECV I og-4 S1/S2 og FECV II 1683 S2 “), mens mutert sekvenser fra FIPV virus ikke var kløyvde av furin.
Når du sammenligner furin-mediert spalting av EMC/2012 S2′ peptid (figur 1A) med FECV I og-4 S1/2 peptider (figur 2A), fant vi at det var en omtrentlig 26-fold forskjell i den v-Max. Dette kan forklares med furin cleavage motivet i begge sekvenser (tabell 1). Minimumskravet furin Kløv er en RXXR motiv, er en RXRR sekvens mye gunstigere2. Derfor EMC/2012 S2′ peptid, som har en RSAR motiv, er kløyvde med mindre spesifisitet sammenlignet med FECV I og-4 S1/2 peptid som inneholder et RSRR furin cleavage område (tabell 1).
Ettall større begrensningen til analysen er imidlertid at peptidene ikke reflekterer tertiær strukturen av proteinet de vanligvis er innebygd i. Spalting av full lengde fusion protein eksponerer fusion peptid og utløsere vert celle oppføring1. Samspillet mellom protease og fusion protein kan også påvirkes av tertiær strukturen av proteinet blanding mens vi antar at peptidene er mer eller mindre lineær. Derfor cleavage oppdaget i peptid analysen kan være kunstig og gjenspeiler kanskje ikke situasjonen i vivo . Dette ble rapportert for spalting av influensa H3N2 HA undertype av matriptase. Mens flere grupper som matriptase i peptid analyser spalting av H3N2 HA, ble det også vist at inkubering av full lengde H3N2 HA protein og matriptase i cellekultur ikke resulterte i en fusogenic HA protein4,20, 21. Det er andre eksempler som viser at biologisk viktig regulering av proteolytisk cleavage er på nivå med protein bekreftelse. Den har blitt beskrevet at fusion proteiner noen ganger trenger en rekke pre fusion hendelser kunne utsette cleavage områdene på fusion. Semliki skog virus fusion protein, for eksempel krever strukturelle rearrangements under en rekke prefusion hendelser for å avsløre sin fusion protein og gjøre den tilgjengelig for proteolytisk aktivisering22. Derfor må resultatene i en fluorogenic peptid analysen godkjennes av cellen smelting analyser eller lignende eksperimenter. Peptid analysen kan imidlertid fortsatt en rask screening av flere protease/peptid kombinasjoner og redusere arbeidskraft og tiden følge opp eksperimenter siden kombinasjoner som ikke viser Kløv er svært sannsynlig vise den samme resultat i vivo.
Andre store begrensning av analysen gjelder proteaser. Så langt er det bare mulig å teste løselig proteaser men ikke transmembrane proteaser. Avhengig av hensikten med eksperimentet, kan dette være et problem. For eksempel aktiveres influensa har av en rekke transmembrane proteaser på cellemembraner8. Til en viss grad problemet kan circumvented med løselig proteolytisk aktive domener, men resultatene må tolkes med forsiktighet og skal valideres med konvensjonelle metoder. Vi skal se eksemplet beforementioned med matriptase og sin aktivitet mot H3N2 HA. I vivo matriptase ligger i cellemembranen men kommersielt tilgjengelig enzymet er løselig katalytisk domenet. Som diskutert med hensyn til fusion proteiner, kan det være mulig at det også krever full lengde protease å samhandle med full lengde protein underlaget cleavage og at testing bare én domener kan resultere i falske positiver.
Denne metoden har vist seg for å være effektivt å studere i spalting av bestemte amino acid sekvenser av furin. Men programmer teknikk utvidelser til alle tilgjengelige protease (f.eks, cathepsins, proprotein konvertasene), gjør den en nyttig metode for skjermen peptid kandidater for protease cleavage. Videre har det vært vist at denne analysen kan også brukes til å teste effekten av proteasehemmere, og derfor gir en rask og enkel verktøyet til skjermen protein hemmere23.
Fluorogenic peptid cleavage analysen beskrevet her representerer et tillegg til bioinformatic cleavage scoring algoritmer, som forutsier peptid spalting av en bestemt protease, basert på aminosyre egenskaper og rekkefølge. Disse to teknikkene, i kombinasjon med tradisjon vestlige blotting teknikker kan brukes som en effektiv måte for å studere protease cleavage i vitro.
The authors have nothing to disclose.
Forskningsmidler for MERS prosjektet presenteres i dette manuskriptet ble levert av NIH gi R21 AI111085. Feline coronavirus studien ble støttet av forskningsmidler fra Morris dyr Foundation, Winn Feline Foundation og Cornell Feline Health Center. Vi ønsker også å takke Malik Peiris for å gi oss med Mor213 orden før det var offentlig tilgjengelig.
Peptides | Biomatik | N/A | |
Furin | NEB | P8077S | |
Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Prism 7 | GraphPad | N/A |