Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Summary

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Abstract

Os osteoclastos são grandes, multinucleados, e células de reabsorção óssea da linhagem monócitos-macrófago que são formadas pela fusão de monócitos ou precursores de macrófago. O reabsorção excessivo do osso é um os mecanismos celulares os mais significativos que conduzem às doenças osteolytic, incluindo a osteoporose, o periodontitis, e o osteolysis periprotético. A principal função fisiológica dos osteoclastos é absorver tanto o componente mineral de hidroxiapatita quanto a matriz orgânica do osso, gerando a aparência característica de reabsorção na superfície dos ossos. Existem relativamente poucos osteoclastos em comparação com outras células do corpo, especialmente em ossos adultos. Estudos recentes têm se concentrado em como obter mais osteoclastos maduros em menos tempo, o que sempre foi um problema. Várias melhorias nas técnicas de isolamento e cultura desenvolveram-se em laboratórios, a fim de obter mais osteoclastos maduros. Aqui, apresentamos um método que isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforço em comparação com o procedimento tradicional, utilizando um dispositivo especial e simples. Com o uso da centrifugação do inclinação da densidade, nós obtemos grandes quantidades de osteoclastos inteiramente diferenciados da medula do osso do rato, que são identificados por métodos clássicos.

Introduction

A homeostase óssea é um processo fisiológico complexo que é regulado por osteoclastos de reabsorção óssea e osteoblastos de formação óssea¹. Um equilíbrio entre a atividade osteoblástica e osteoclástica mediada por osteoblastos e osteoclastos, respectivamente, é altamente essencial para manter a saúde óssea e a homeostase, pois as perturbações na homeostase óssea podem levar a doenças ósseas, tais como crescimento ósseo anormal ou perda da densidade óssea. Como células únicas de reabsorção óssea, os osteoclastos são importantes em doenças relacionadas à destruição óssea anormal, incluindo osteoporose, periodontite e osteólise periprotética^2,3.

O desenvolvimento de uma cultura osteoclast é dividido principalmente em dois estágios. Os métodos estabelecidos por Boyde et al.⁴ e Chambers et al.⁵ compuseram a primeira etapa na década de 1980. Obtiveram osteoclastos relativamente abundantes dos ossos de animais recém-nascidos, que é o período de remodelação rápido. Os osteoclastos são liberados fragmentando e agitando os ossos em um meio especial. No entanto, as células obtidas por este método são baixas em quantidade e pureza. O segundo estágio foi o desenvolvimento de culturas de longa distância de formação de osteoclast, utilizando células de linhagem hematopoiéticas derivadas da medula óssea⁶. Citocinas, como 1α, 25-dihidroxivitamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2) e hormônio paratireóide (PTH), que são adicionadas ao meio de cultura, atuam através do sistema de osteoblastos/células estromais para estimular a formação de osteoclast^7,8 . Entretanto, a pureza e a quantidade de osteoclastos obtidos por este método não podem encontrar as necessidades da pesquisa moderna da biologia molecular. Então, a descoberta do fator deestimulação do macrófago (M-CSF) e do activador do receptor para o ligante do fator-κB nuclear (RANKL) faz a osteoclastogênese mais fácil^9,10,11, e o método de usar M-CSF e RANKL para estimular diretamente osteoclast formação é amplamente utilizado em todo o mundo. No entanto, ainda existem alguns detalhes na metodologia que precisam ser melhoradas.

Atualmente, o método de cultura osteoclast mais comumente utilizado, como descrito por Marino et al.¹² e Pei et al.¹³, muitas vezes requer a remoção do tecido circundante ao redor do osso e usa uma agulha esterilizada para liberar a cavidade da medula com mídia concluída. Há algumas desvantagens para este processo, incluindo o fato de que (1) a remoção do tecido circundante ao redor do osso requer muito tempo e grande técnica cirúrgica, (2) os ossos são frágeis e podem levar à saída da medula óssea, (3) a cavidade da medula óssea pode ser demasiado minúsculo para nivelar, e (4) há um risco de ferimento da vara da agulha. Para evitar estes problemas, nós centrifugamos os tubos contendo os ossos para a medula óssea em vez de agulha-liberando a medula óssea. Aqui, apresentamos um método estável e seguro que isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforço em comparação com o procedimento tradicional. Juntamente com o uso da centrifugação de gradiente de densidade, obtemos grandes quantidades de osteoclastos totalmente diferenciados in vitro.

Protocol

Todos os métodos que envolvem os animais aqui descritos são aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de medicina chinesa de Nanjing. 1. configuração Prepare várias pontas de pipeta de 1 mL longitudinalmente cortadas (1 cm) e vários tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Põr as pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador em 103 kPa e em 121 ° c por 20 minutos e assegure-se de que estejam estéreis. Prepare uma caix…

Representative Results

A finalidade do protocolo era isolar e purificar grandes números de precursores do osteoclast convenientemente e induzir osteoclastos com sucesso. Suplementando com o M-CSF e o RANKL, os osteoclastos gigantes foram vistos nos dias 5 – 6. A formação de osteoclastos foi identificada com sucesso pela coloração TRAP (Figura 1a). As pilhas grandes e roxas foram consideradas como pilhas armadilha-positivas com núcleos múltiplos (tipicamente ≥ três núcl…

Discussion

A capacidade de obter e estudar osteoclastos in vitro é uma habilidade crítica e fundamental para qualquer pesquisador que deseje estudar o metabolismo ósseo, o que pode ajudar a compreender os mecanismos de doenças absorventes de ossos e desenvolver novos agentes terapêuticos. O presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.

Usando pontas da pipeta e os tubos do microcentrifugador para obter a medula, reduziu pela maior parte o tempo da…

Materials

Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatic Hard Tissue Slicer	Lecia	RM2265
Bovine femoral bone			Purchased by ourselves
Cell Incubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum	Sarana	s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hard Tissue Grinders	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX31
Inverted Fluorescence Microscope	Lecia	DMI-3000
MEM, no Glutamine	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649