Isolering, rening och differentiering av Osteoklast prekursorer från råtta benmärg
Summary
Osteoclasts är vävnadsspecifika makrofagpolykaryoner härledda från monocyt-makrofaghärstamning av hematopoetiska stamceller. Detta protokoll beskriver hur man isolerar benmärgs celler så att stora mängder osteoklaster erhålls samtidigt som risken för olyckor som påträffas i traditionella metoder minskas.
Abstract
Osteoclasts är stora, multinukleerade, och benresorbering celler av monocyt-makrofaghärstamning som bildas av fusion av monocyter eller makrofagprekursorer. Överdriven benresorption är en av de mest signifikanta cellulära mekanismer som leder till osteolytiska sjukdomar, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys. Den huvudsakliga fysiologiska funktionen av Osteoklasterna är att absorbera både hydroxyapatit mineral komponenten och den organiska matrisen av ben, generera den karakteristiska benresorption utseende på ytan av ben. Det finns relativt få Osteoklasterna jämfört med andra celler i kroppen, särskilt i vuxna ben. Nyligen genomförda studier har fokuserat på hur man kan få mer mogna Osteoklasterna på kortare tid, vilket alltid har varit ett problem. Flera förbättringar av isolerings-och odlings teknikerna har utvecklats i laboratorier för att få mer mogna osteoklaster. Här introducerar vi en metod som isolerar benmärg på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet, med hjälp av en speciell och enkel enhet. Med hjälp av densitetsgradient centrifugering, vi får stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna från råtta benmärg, som identifieras med klassiska metoder.
Introduction
Ben homeostas är en komplex fysiologisk process som regleras av benresorbering Osteoklasterna och benbildande osteoblaster1. En balans mellan osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet medierad genom osteoblaster och osteoklaster, respektive, är mycket viktigt för att upprätthålla benhälsa och homeostas, eftersom störningar i ben homeostas kan leda till skelett sjukdomar, såsom onormal ben tillväxt eller förlust av ben täthet. Som unika ben-resorption celler, Osteoklasterna är viktiga vid sjukdomar relaterade till onormal ben förstörelse, inklusive osteoporos, parodontit, och periprotetiska Osteolys2,3.
Utvecklingen av en osteoklast kultur är huvudsakligen uppdelad i två steg. De metoder som fastställdes av Boyde et al.4 och Chambers et al.5 bestod av den första etappen på 1980-talet. De erhöll relativt riklig Osteoklasterna från benen på nyfödda djur, vilket är den snabba remodeling period. Osteoclasts frigörs genom att fragmentera och omrörning benen i ett speciellt medium. De celler som erhålls med denna metod är dock låga i kvantitet och renhet. Den andra etappen var utvecklingen av långväga kulturer av osteoklast bildning, med hjälp av hematopoetiska härstamning celler som härrör från benmärg6. Cytokiner, såsom 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), och parathormon (pth), som tillsätts i odlings mediet, verkar genom systemet med osteoblaster/stromaceller för att stimulera osteoklastbildningen7,8 . Den renhet och mängd osteoklaster som erhålls genom denna metod kan dock inte tillgodose behoven hos modern molekylär biologisk forskning. Sedan, upptäckten av makrofag Colony-stimulerande faktor (M-CSF) och receptor Activator för nukleär faktor-κb ligand (Rankl) gör osteoclastogenesis lättare9,10,11, och metoden för att använda M-CSF och RANKL att direkt stimulera osteoklast formation används i stor utsträckning runt om i världen. Det finns dock fortfarande vissa detaljer i den metod som behöver förbättras.
För närvarande, den vanligaste osteoklast kulturen metod, som beskrivs av Marino et al.12 och Pei et al.13, ofta kräver avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet och använder en steriliserad nål för att spola benmärg hålighet med färdigställda medier. Det finns vissa nack delar med denna process, inklusive det faktum att (1) avlägsnande av den omgivande vävnaden runt benet kräver mycket tid och stor kirurgisk teknik, (2) benen är sköra och kan leda till benmärg utflöde, (3) benmärg hålighet kan vara för liten för att spola, och (4) det finns en risk för nålstick skada. För att undvika dessa problem, vi Centrifugera rören som innehåller benen för benmärg i stället för nål-spolning benmärgen. Här introducerar vi en stabil och säker metod som isolerar benmärgen på kortare tid och med mindre ansträngning jämfört med det traditionella förfarandet. Tillsammans med användning av densitetsgradient centrifugering, vi erhåller stora mängder av fullt differentierade Osteoklasterna in vitro-.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmågan att få och studera Osteoklasterna in vitro-är en kritisk och grundläggande färdighet för alla forskare som vill studera benmetabolism, som kan bidra till att förstå mekanismerna för benabsorberande sjukdomar och utveckla nya terapeutiska medel. I den här studien beskrevs ett protokoll med vissa modifieringar baserade på tidigare metoder.
Genom att använda pipettspetsar och mikrocentrifugrör för att få benmärg minskade det till stor del Operations tiden för att få be…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81473692) till Yong ma. Författarna tackar alla anställda vid Medical Research Center i den första hög skolan för klinisk medicin i Nanjing University of Chinese Medicine.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).
- Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).
- Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).
- Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
- Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).
- Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
- Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).
- Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).
- Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).
- Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
- Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25 (1), 1-8 (1999).
