Här presenterar vi ett protokoll för Invivo validering av hydrogel-baserade cellterapi, illustrerad av exemplet av ötransplantation. h-Omental Matrix Islet fyllning (målsökande) implantation tillåter implantation av en cell-hydrogel blandning mellan omental skikten, nära blodkärl, att maximera engraftment i en ordentlig metabola miljö.
Regenerativ medicin baserat på cellterapi representerar ett nytt hopp för att bota sjukdomen. Nuvarande hinder inkluderar korrekt i vivo validering av effektiviteten av behandlingen. För överföring till det mottagande organet behöver celler ofta kombineras med biomaterial, särskilt hydrogels. Validering av effekten av sådana ett transplantat kräver dock rätt miljö, den högra hydrogel och webbplatsen rätt mottagare. Omentum kanske sådan webbplats. Baserat på exemplet av ötransplantation utvecklat vi den målsökande (h-Omental Matrix Islet fyllning) teknik, som består av injektion av graften inuti vävnaden, mellan de omental lager för att förbättra holme implantation och överlevnad. För att uppnå detta, måste holmar vara inbäddade i en hydrogel med en viskositet som gör att dess injektion med en atraumatiska kanylen. Sprutor är laddade med en kombination av hydrogel och holmar. Flera injektioner utförs inuti den omental vävnaden på olika startpunkter och nedfall av Holmen/hydrogel blandningen görs längs en linje. Vi testade genomförbarheten av denna innovativa metod med dextran pärlor. Pärlor var väl spridda omental vävnad, i nära närhet till blodkärlen. För att testa effekten av transplantat, vi transplanteras holmar i diabetiska råttor och utför en metabolisk uppföljning över två månader. De transplanterade holmarna uppvisade en hög grad av re vaskularisering runt och släpper holmar och vände diabetes. Den målsökande tekniken kunna tillämpas för andra typer av hydrogel eller cell terapi, för celler med höga metaboliska aktiviteten.
Cellterapi är ett hett ämne, eftersom det syftar till att bota sjukdomar baserat på den regenerativ medicinen. Biologiska material-assisted cellterapi har alltmer studerats under de senaste åren, särskilt eftersom cellen implantation ofta kräver en bärare för överföring av celler från kultur skålen till mottagaren. Biomaterial ställningar är potentiellt värdefulla cell bärare som uppfyller flera roller1. Behöriga bärare bör skydda celler från mekaniska spänningar och ge god tillväxt villkor, såsom viktiga tillväxtfaktorer, metaboliska avfall utsöndring, utbyte av näringsämnen och syre2.
Bland de olika typerna av biomaterial används i cellterapi, har hydrogeler många fördelar. De är biokompatibla, biologiskt nedbrytbar, enkel att hantera, och underlätta syre diffusion3. Dessutom tillåter dagens teknik användning av hydrogeler för att hjälpa cellerna överleva och engraft med, till exempel tillskott med tillväxtfaktorer eller extra-cellulära matrix proteiner4.
Hydrogel bärare som innehåller stamceller kan injiceras som behandlingar, e.g., bone regeneration5 och nervsystemet sjukdom6. Implantation av metaboliskt aktiva celler behövs. In vitro-validering av metoden är möjligt, återstår verktyg och tekniker för Invivo validering förfinas.
Cell- och hydrogel transplantation kan enkelt utföras genom subkutan injektion när biokompatibilitet tester utförs. Detta subkutan lokalisering är dock inte optimal, huvudsakligen i form av venös dränering7när ympade celler är tänkta att reglera systemisk faktorer av sin metaboliska verkan. Därför finns det inga aktuella verktyg för att snabbt, säkert och effektivt utvärdera de positiva effekterna av en hydrogel. Baserat på exemplet av ötransplantation, som kräver att hormoner att släppas in i blodomloppet från graften svar på blodsockernivåerna, utvecklat vi en ny metod för cell/hydrogel implantation Invivo.
Det första steget var att identifiera en acceptor transplantation webbplats, som kan acceptera en hydrogel med celler. Omentum erbjuder ett stort utrymme för implantation, är mycket plast, och dess täta vaskularisering kombinerat med inställningen intraperitoneal är intressant för att studera celler som har hög metabolisk aktivitet8. Vi behövde nästa upprätta en kirurgisk teknik som möjliggör överföring av cellerna och hydrogel i omentum. Inspirerad av den kroppseget fett används i plastikkirurgi9, vi utvecklat h-Omental Matrix Holmen fyllning (målsökande) tillvägagångssätt. Holmar inbäddade i hydrogel injiceras inuti omental vävnaden. Tekniken också syftar till att ge maximal engraftment genom att utnyttja flera nedfall av cellen och hydrogel blandningen i omental vävnaden, där det stora antalet blodkärl också förbättrar transplantat syresättning.
I föreliggande studie beskriver vi en enkel och innovativ teknik för holme implantation mellan omental ark, släpper fettvävnad närmast av blodkärlen. Denna består av mikro-invasiv kirurgi, som kunde slutföras under laparoskopi, med injektion av holmar som ingår i en hydrogel i fettvävnad. Denna teknik är enkelt tillämpas på alla kombinationer av hydrogel och cell som måste testas i en i en metaboliskt funktionell miljö.
Vissa kritiska steg kan lyftas fram i detta protokoll. Först, den person som utför operationen och manipulera vävnaderna måste delikat med fettvävnad, som den är bräcklig. Krossa eller skada omentum måste undvikas. Omentum, anrikas som en defensiv vävnad, i makrofager och andra leukocyter. Dessa immunceller kan aktiveras av överdriven manipulation och påverka negativt graften. För det andra är transplantat (holme-hydrogel blandning) lastning också kritisk. Den person som utför proceduren måste undvika döda volymer och måste ladda alla av hydrogel-holme blandningen in i injektion enheten. Omedelbart efter detta steg är en annan kritisk punkt själva injektionen. Injektionen måste utföras långsamt, med omsorg och varsamt. Sprutan måste blåsas genom den tomma hydrogel laddade från början för att hämta eventuella återstående holmar. För det tredje, suturering måste göras noggrant och i två steg. Muskulös planen bör vara sys först, utan för att suturera omentum med muskeln, och huden bör vara sys separat. Om explantation förfarandet för omental transplantat, bör särskild uppmärksamhet tas just nu när artärerna nära magen (gastroepiploic artärer) är anskäras. Det är viktigt att uppmärksamma eventuella blödningar som inträffar och stoppa dem före suturering djuret, eftersom någon ihållande blödning leder till djurs död inom några dagar.
Felsökning kan vara nödvändigt om mediet för att bära holmar; valet av hydrogel är upp till experimenter, så länge hydrogel är injicerbara. Användning av olika material kan resultera i variabel ympa funktion (med eller utan tillskott, till exempel). Den metod som beskrivs här har visat sin effektivitet för inert co stolpsättning material med en holme förhållandet 7660 IEQ/kg.
Denna metod kan begränsas av omental storlek och hydrogel boenden. För att använda en diabetiker gnagare modell, är insulinbehandling obligatoriskt före holme implantation att tillhandahålla tillräckliga ympning området. Diabetiker gnagare förlora en hel del vikt och fettmassa på grund av STZ-inducerad diabetes. Med tanke på de lilla väger djuren ingick i denna studie, är ympning i ett ännu mindre område inte möjligt.
Bevarande av ordentlig glycemia management (före transplantation med pellets och därefter använda långverkande insulin) är obligatoriskt. Här valde vi att bevara insulin pelleten fram till dagen för transplantation av flera skäl. Först, upprätthållandet av en god glykemisk kontroll avsevärt minskar oxidativ stress induceras av diabetes hos de mottagande organ, som kan vara skadliga för holme transplantat11 och tillåter fortsatt intensiv insulinbehandling och mottagaren beredning som observerats i kliniken12. För det andra, vi ville begränsa det maximala antalet anestesi förfaranden för råttorna. När det gäller genomförandet av insulinbehandling under metabola uppföljning med långverkande insulin, undvek systemet används massiva komplikationer på grund av glucotoxicity (som kan förstöra ympkvistar) och att bevara en ”riktig” glycemia värde.
För att övervaka transplantat effektivitet, är glycemia inte en relevant parameter i de första dagarna, om råttor får insulinbehandling med pellets. Det är därför kontrollera C-peptid nivån flera gånger tidigare att transplantera är obligatoriskt. Dessa tider finns i början av studien, att välja djur efter STZ injektion, och sedan bara före transplantation, för att säkerställa att råttor förblir diabetiker och att förnyelse är minimal.
Hydrogel är också viktig. Flytande hydrogel kommer att läcka ut från omental vävnad och högviskösa hydrogel kan inte injicerbara. Hydrogel viskositet och inmatningskapacitet har testas före användning, men det verkar nödvändigt att också testa materialet direkt genom utvärdering av holme eller en annan celler överlevnad in vitro. Här, kan holmar är mycket känsliga för syrebrist och användning av högviskösa bärare påverka syre diffusion.
När det gäller betydelsen av den metod som beskrivs här med avseende på befintliga metoder, har denna intra-vävnad transplantation teknik fördelar i termen av reproducerbarhet. Det är också atraumatiska för vävnaden och, på grund av dess extra vaskulär läge, undviker risker som blödning och trombos. Också, när man överväger ötransplantation, instant blod-medierad inflammatorisk reaktion är undvikas14. Dessutom tillåter hOMING omplantering holmar i en icke-vitala organ, till skillnad från transplantationen i levern, vilket innebär risker i form av leverfunktion15.
För att producera optimala prestanda, har en hydrogel kan anpassas till de celler som det kommer att fortsätta. Användning av tillväxtfaktorer eller specifika proteiner kan ha en positiv effekt på transplanterade celler16,17.
Avslutningsvis, kan denna teknik användas för Invivo validering av en hydrogel på olika celltyper, särskilt när en aktiva metaboliska miljö behövs, när det gäller holmar. Dessutom denna operationsteknik är tillämplig på flera program och kunde vara, i framtiden, snabbt överföras till människor, eftersom det enkelt kan utföras med laparoskopi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM; 53/14/C1. Författarna är tacksam för att laget av Pr. Bruant-Rodier från Strasbourgs Hôpitaux Universitaires de hjälper till att utveckla denna innovativa teknik.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |