Lucifer पीला - मानव रक्त मस्तिष्क बैरियर के एक सेल मॉडल में एक मजबूत Paracellular स्थायित्व मार्कर
Summary
हम एक फ्लोरोसेंट परख प्रस्तुत करने के लिए प्रदर्शित करता है कि Lucifer पीला (LY) एक मजबूत मार्कर hCMEC/D3 सेल monolayers, मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के एक इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन विट्रो मॉडल की स्पष्ट paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए है. हमने इस परख का उपयोग सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं में एक-प्रवाही मोनोलेयर गठन की गतिज ताक का प्रयोग किया।
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा BBB endothelial कोशिकाओं है कि प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच एक बाधा फार्म गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान प्रदान को रोकने के होते हैं. तंग जंक्शनों (टीजे) प्रभावी ढंग से एक परतों में paracellular अंतरिक्ष एक बरकरार बाधा में जिसके परिणामस्वरूप सील. यह अध्ययन एक LY-आधारित फ्लोरोसेंट परख का वर्णन करता है जिसका उपयोग इसकी स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पीऐप)निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और बदले में इसका उपयोग संप्रवाही मोनोलेयरों के गठन की गतिजता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और परिणामस्वरूप तंग जंक्शन HCMEC/D3 मोनोलेयर्स में बाधा अखंडता। हम आगे transfected कोशिकाओं में TJ कार्यात्मक अखंडता निर्धारित करने के लिए इस परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करता है. एलई पीएप्लिकेशन परख से हमारे डेटा से पता चलता है कि hCMEC/D3 कोशिकाओं को एक ट्रांसवेल सेटअप में वरीयता प्राप्त प्रभावी ढंग से LY paracellular परिवहन 7 दिन के बाद संस्कृति सीमा. प्रस्तुत परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता के रूप में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि डीएनए नैनोकण transfection एचसीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स में LY paracellular परिवहन को परिवर्तित नहीं करता है।
Introduction
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मस्तिष्क के ऊतकों में प्लाज्मा घटकों के प्रवाह को सीमित सुरक्षात्मक बाधा है और इस तरह के pericytes के रूप में समर्थन कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के होते हैं. बीबीबी की प्रमुख भूमिका एक अवरोध के रूप में काम करना है जो परिधीय रक्त और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के बीच की जगह को सील करता है ताकि तंत्रिका सूक्ष्म पर्यावरण1,2के हेमोस्टेसिस को बनाए रख सके . मस्तिष्क केशिका अंत:संवदेलिया कोशिकाएं अंतरकोशिकीय तंग जंक्शनों (टीजे)1के गठन के माध्यम से परकोशिकीय मार्ग को प्रभावी ढंग से सील करती हैं। यह सुरक्षात्मक बाधा ग्लूकोज और चयनित पोषक तत्वों मस्तिष्क में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जबकि यह आयनों के बहुमत को रोकता है, विषाक्त पदार्थों और दवाओं इस तंग बाधा के माध्यम से गुजर से. इसकी सुरक्षात्मक भूमिका के अलावा, बीबीबी का प्राकृतिक अवरोध समारोह सीएनएस को लक्षित करने वाली दवा वितरण प्रणालियों के विकास में एक गंभीर चुनौती बन गया है।
BBB के इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल अपने जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए और TJ बाधा अखंडता पर दवा उपचार के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हैं. हम एक इन विट्रो मॉडल के रूप में मानव मस्तिष्क microvascular endothelial सेल लाइन (hCMEC/D3) का इस्तेमाल किया क्योंकि यह मानव मस्तिष्क endothelium3 के एक स्वीकार किए जाते हैं मॉडल है और मानव BBB के कई कार्यों recapitulates. hCMEC/D3is इन विट्रो4,5,6,7,8,9में BBB मॉडलिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेल लाइनों में से एक . transendothelial विद्युत प्रतिरोध (टीईईईईआर) के अपने अपेक्षाकृत कम मूल्यों के बावजूद, बाधा जकड़न का एक उपाय है, इस सेल लाइन मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के रूप में रूपात्मक और कार्यात्मक गुणों के अधिकांश बरकरार रखती है, यहां तक कि की अनुपस्थिति में एक मोनोकल्चर के रूप में सहकृषि ग्लिल कोशिकाएं6,7. HCMEC/D3 सेल लाइन सक्रिय ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स सहित कई BBB मार्करों व्यक्त करता है जब तक लगभग मार्ग 35 अस्थिर phenotypes6,7,9 के लिए dedifferentiation के दौर से गुजर के बिना ,10,11. इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन की सबसे उल्लेखनीय विशेषता टीजे5,9,11,12बनाने की क्षमता है . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल hCMEC/D3 सेल लाइन के साथ तुलना में कई अध्ययनों में उच्च पारगम्यता से पता चला है और वे कुछ BBB मार्करों व्यक्त करते हैं, वे अभी तक सबसे आम BBB सेल मॉडल13के रूप में विकसित करने के लिए कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल अधिकतम मार्ग संख्या है कि कोशिकाओं को स्थिर BBB phenotypes14बनाए रखने के लिए अनुमति देने के संबंध में विशेषता होना शेष है.
तीन प्राथमिक तरीकों आमतौर पर टीजे बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, TEER की माप सहित, स्पष्ट पारगम्य गुणांक की माप (पीअनुप्रयोग) इस तरह के सुक्रोज, inulin, Lucifer पीला के रूप में छोटे हाइड्रोफिलिक अनुरेखक अणुओं की, आदि और TJs के ज्ञात आणविक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग जैसे कि क्लाउडिन-5, जेडओ-1, ऑक्लूडिन, आदि5. टीईईईआर एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि है जो छिद्रयुक्त झिल्ली पर सुसंस्कृत कोशिका मोनोलेयरों के पार विद्युत प्रतिरोध को मापता है. हालांकि, TEER मूल्यों इस तरह की संस्कृति माध्यम की संरचना और माप साधन के प्रकार के रूप में प्रयोगात्मक चर से प्रभावित किया जा सकता है। इन कारकों के संभावित संयोजन से 2-21 दिनों 13 के लिए सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन में2 से 1150 सेमी2 तक के टीईईआर मूल्यों का व्यापक वितरण होता है। इम्यूनोस्टेनिंग एंटीबॉडी का उपयोग करलक्षित प्रोटीन लेबलिंग द्वारा टीजे प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक दृश्य विधि है। हालांकि, इम्यूनोस्टेनिंग में प्रयोगात्मक चरणों की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें प्रयोगात्मक कलाकृतियों में परिणाम हो सकने वाली कोशिकाओं को ठीक करने/परमेबिलाइज़ करने की आवश्यकता शामिल है और फ्लोरोसेंट सिग्नल समय के साथ फीका हो सकते हैं। उपरोक्त कारकों व्यक्तिपरक त्रुटियों डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इस कार्य का प्राथमिक फोकस एक LY-आधारित स्पष्ट पारगम्यता परख को सुसंस्कृत hCMEC/D3 कोशिकाओं में एक confluent मोनोलेयर गठन की गतिज निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत करने के लिए है। हालांकि अन्य उन्नत इन विट्रो BBB सिस्टम, जैसे सह-संस्कृति प्रणाली, microfluidic सिस्टम, शारीरिक रूप से काफी सुधार बाधा समारोह15,16,17, hCMEC / ट्रांसवेल सेटअप टीजे गठन की गतिज ताकने और बाधा समारोह पर विभिन्न दवा योगों के प्रभाव को तेजी से स्क्रीन करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय मॉडल है। सामान्य में, पीएप्लिकेशन मूल्यों hCMEC/D3 monolayers में विभिन्न हाइड्रोफिलिक विलेय के लिए संगत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न कम आणविक द्रव्यमान विलेय के लिए रिपोर्ट किए गए पीऐप मान (जैसे कि सुक्रोज, मैनिटॉल, एलई, आदि) विभिन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल में 10 -4 सेमी/ , 20.हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं कोशिका लगाव और monolayer गठन के लिए एक कोलेजन लेपित microporous झिल्ली पर बीज रहे हैं में विवो बाधा की नकल. शीर्ष पक्ष में जोड़ा गया लया गया अंतरकोशिकीय तंग संधिओं को पार करने और बासोपार्श्विक पक्ष में जमा होने की आशा है। बासोपार्श्व पक्ष में एलएचई की अधिक सांद्रता एक अपरिपक्व, पूर्ण रूप से कार्यात्मक बाधा का संकेत देती है, जबकि कम सांद्रता एक परिपक्व बाधा में जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक टीजे की उपस्थिति के कारण प्रतिबंधित परिवहन को प्रतिबिंबित करती है।
एलई एक हाइड्रोफिलिक डाई है जिसमें अलग-अलग उत्तेजना/उत्सर्जन चोटियों होती है और सुक्रोज, मैनिटॉल या इनुलिन जैसे रेडियोलेबल ट्रेसर अणुओं की आवश्यकता से बचा जाता है। इस प्रकार, एलई के फ्लोरोसेंट मानों का उपयोग BBB मोनोलेयर्स में इसकी पारकोशिकीयता की प्रत्यक्ष गणना करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, जैव चिकित्सा क्षेत्रों में उपयोग किए जाने वाले कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों की तुलना में जो फ्लोरोरेसिन21जैसे छोटे स्टोक्स शिफ्ट से पीड़ित हैं, एलआई के स्टोक्स शिफ्ट पर्याप्त वर्णक्रमीय जुदाई के साथ लगभग 108 एनएम है, इस प्रकार एलआई फ्लोरोसेंस डेटा को एक के रूप में अनुमति देता है paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए मजबूत readout. हम एक orthogonal तकनीक के रूप में पश्चिमी blotting का इस्तेमाल किया तंग जंक्शन मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए, $O-1, संस्कृति के समय पर. ओओ-1 अभिव्यक्ति पश्चिमी blotting के माध्यम से पता चला LY Pएप्लिकेशन डेटा के पूरक और संयोजन में प्रयोग किया जाता है, इन आंकड़ों का सुझाव है कि LY Pअनुप्रयोग मूल्यों में मनाया परिवर्तन में क्रमिक वृद्धि के साथ एक मोनोलेयर के गठन के चिंतनशील है तंग जंक्शन मार्कर की अभिव्यक्ति, $O-1.
जैसा कि पहले बताया गया है, इस काम का केंद्रीय ध्यान कार्यात्मक तंग जंक्शनों के साथ एक confluent monolayer के गठन की निगरानी के लिए एक सरल तकनीक के रूप में एक LY परख प्रदर्शित करने के लिए है. हालांकि, विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम डीएनए नैनोकण में LY पीएप्लिकेशन को मापा-transfected hCMEC / न्यूक्लिक अम्लों को पॉलिमर के धनावेशित समूहों तथा न्यूक्लिक अम्लों के ऋणावेषित फॉस्फेट समूहों के बीच स्थिर वैद्युत अन्योन्यक्रिया के माध्यम से 100-200 दउ के व्यास वाले पॉलीइलेक्ट्रोलाइट नैनोकणों में संघनित किया जा सकताहै, 23हम अपने काम में डीएनए नैनोकणों (डीएनए एन पी एस) के रूप में इन परिसरों का उल्लेख करते हैं। जबकि हमारा इरादा कोशिकाओं transfect और वांछित प्रोटीन व्यक्त करने के लिए है, हम यह सुनिश्चित करना चाहिए कि hCMEC/D3 monolayers के बाधा गुण समझौता नहीं कर रहे हैं. हमारे डेटा से पता चलता है कि एक मानक 4 एच luciferase जीन transfection शासन measurably LY Pएप्लिकेशन परख की उपयोगिता का प्रदर्शन TJ बाधा अखंडता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए परिवर्तन नहीं करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
BBB की एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान-प्रदान को रोकने के लिए तंत्रिका microenvironment के hemostasis बनाए रखने के लिए है. BBB की विशेषता विशेषत?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ फार्मेसी से 2017 के नए अन्वेषक पुरस्कार से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं, डुकस्ने विश्वविद्यालय से एक Hunkele dreaded रोग पुरस्कार और Manickam प्रयोगशाला के लिए फार्मेसी शुरू हुआ धन के स्कूल. हम पश्चिमी blotting सहायता के लिए रिसाव प्रयोगशाला (डुकस्ने विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं और उनके ओडिसी 16-बिट imager के उपयोग की अनुमति. हम पश्चिमी सोख्ता के साथ मदद के लिए कांदरद दवे (मानिकम प्रयोगशाला) के लिए प्रशंसा का एक विशेष नोट भी शामिल करना चाहेंगे।
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
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