Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц
Summary
Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».
Abstract
Эндотелиальные клетки скелетной мускулатуры капилляров (микрососудистой эндотелиальных клеток мышц, MMEC) создать барьер между поток крови и скелетных мышц, регулирующий обмен жидкости и питательных веществ, а также иммунный ответ против инфекционных агенты, контролируя иммунные клетки миграции. Для выполнения этих функций, MMEC формируют функциональные «группа myovascular» (МВУ), с дальнейшей типов клеток, фибробластов, pericytes и скелетных мышечных клеток. Следовательно дисфункция MMEC и, следовательно, МВУ способствует разнообразие миопатий. Однако механизмы регулирования MMEC в здоровье и болезни по-прежнему недостаточно понятны и их разъяснение предшествует более конкретные лечения миопатии. Изоляции и углубленного исследования первичного MMEC функций в контексте МВУ может способствовать лучшему пониманию этих процессов.
Эта статья предоставляет протокол изолировать первичной мышиных MMEC скелетных мышц, механических и ферментативные диссоциации, включая очистки и культура обслуживания шаги.
Introduction
С кислородом, субстратов и других необходимых молекул поставляются через кровоток, клеток и органов. Этот обмен происходит в капиллярах, мельчайших сосудов. Капилляров образуются слоя внутренний эндотелиальных клеток (EC), целостность которого остается необходимым условием для успешного регуляции гомеостаза мышц между внутрисосудистого и интерстициального пространства. Для обеспечения выборочной переход клеток и растворимых факторов, ЕС составляют монослоя, плотно соединены и adherens соединения 1. Помимо своей роли как барьер для питательных веществ или продуктов метаболизма EC регулируют набор лейкоцитов при воспалительных процессах. Воспаление или ткани повреждение приводит к вверх регулирование молекул адгезии на поверхности EC и производство chemokines, содействия лейкоцита привязанность и переселение в целевой ткани 2. Следовательно ЕС критически участвуют в регуляции воспалительных процессов, таких как обороны против патогенов или восстановления тканей.
Дисфункция ЕС, непосредственно связанные с сосудистые заболевания, хроническая почечная недостаточность, тромбоз тяжелой возбудителя инфекции. Кроме того ЕС практически всегда участвуют в орган конкретных аутоиммунных заболеваний таких, как сахарный диабет или рассеянный склероз 3. Поэтому функцию барьера между поток крови и органов контролируется согласованного взаимодействия различных типов клеток. В скелетных мышцах микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC) вместе с мышечных клеток, фибробластов и pericytes образуют функциональный блок, «myovascular» (МВУ). Таким образом дисфункции МВУ может играть решающую роль в патофизиологии миопатий. Однако более глубокое понимание этих механизмов регулирования все еще отсутствует и в настоящее время препятствует выявлению новых, срочно необходимых, терапевтических целей в миопатий.
Для расследования сложных физиологических и патофизиологических механизмов, обычно используются Животные модели. Однако в пробирке модели предлагают преимущество сосредоточиться на предмет интереса, исключив различных смешанных факторов. Чтобы исследовать процессы в пробирке это необходимо изолировать чистой и жизнеспособных первичных элементов. В отличие от клеточных линий первичные элементы изолированы от трансгенных животных позволяют исследовать последствия генетических модификаций в пробирке.
Здесь метод, чтобы изолировать первичной мышиных MMEC описан с помощью механических и ферментативные диссоциации, следуют магнитные активированных клеток, сортировка методов (MCS) для очистки. Для этой цели используются магнитные шарики против конкретных поверхностных маркеров. Тромбоцитов эндотелиальных клеток адгезии молекулы-1 (PECAM1, CD31) выражается главным образом на ЕС и может использоваться для обогащения этого типа ячейки. Чтобы оправдать высокие ячейки чистоты, клеток кроветворных происхождения исключены негативный выбор для белка тирозинкиназы фосфатазы рецептор типа C (PTPRC, CD45). Кроме того контроль качества, культивирование первичного мышиных MMEC, потенциальные применения и ограничения, а также особые соображения представлены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроваскулярная эндотелиальные клетки обеспечивают барьерные функции во всех тканях и результаты их дисфункции в болезни ассоциированных органов 3. Кроме того орган конкретных исследования микрососудистой ЕС может проложить путь для новых терапевтических стратегий. Т?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана, «еще Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 TR), «Инновационные Medizinische Тюрингия (МВФ) Münster» (I-RU211811 для TR) и Немецкий исследовательский фонд (DFG, INST 2105/27-1, меня 3283/5-1 и меня 3283/6-1 к SGM). Иллюстрированный изображения, предоставляемые Хайке Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
