3D סריקה תלת-ממדית מיקרומעגלים ותמונות המוח המקברקנה בתלת-ממד הטבעה בפרוטוקול החופף
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול ניסיוני באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית המגשר על שני סולמות מרחביים: הסולם המרחבי המקסקופי של אנטומיה מוחית שלמה המועלת על-ידי MRI ב-> 100 יקרומטר ובקנה המידה המרחבי המיקרוסקופי של הפצות עצבי באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיה ומערכת מערך רב אלקטרודה ושיטות אחרות (~ 10 μm).
Abstract
המוח האנושי, להיות מערכת רב-היקף, יש שני אותות חשמליים מאקרוסקופי, הזורם באופן כללי לאורך חבילות סיבים עבים החומר הלבן, וקוצים עצביים מיקרוסקופיים, הפצת לאורך אקסונים ו דנדטים. שני הקשקשים משלימים היבטים שונים של פונקציות קוגניטיביות והתנהגותיות אנושיות. ברמה המקרו-מקרוסקופית, MRI הינו טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית הנוכחית, שבה הרזולוציה המרחבית הקטנה ביותר, גודל voxel, היא 0.1 – 1 מ”מ3. כמו כן, ברמה המיקרוסקופית, מחקרים פיזיולוגיים קודמים היו מודעים לארכיטקטורות נוירואליות שאינן אחידה בתוך voxels כאלה. מחקר זה מפתח דרך רבת עוצמה להטביע במדויק נתונים מיקרוסקופיים לתוך מפת מאקרוסקופי על ידי מחקר מדעי ביולוגי ממשק עם פיתוחים טכנולוגיים בטכנולוגיית סריקה תלת-ממדית. מאז 3D טכנולוגיה סריקה בעיקר שימש הנדסה ועיצוב תעשייתי עד עכשיו, זה מחדש בפעם הראשונה כדי להטביע מיקרוקישוריות לתוך המוח כולו תוך שמירה על העולה הטבעי בתאי המוח החיים. על מנת להשיג מטרה זו, הראשון, בנינו פרוטוקול סריקה כדי להשיג תמונות 3D מדויקים מהחיים ביו אורגניזמים מאוד מאתגרת לתמונה בשל לחות משטחים רפלקטיבית. שנית, אנו מאומנים לשמור על מהירות כדי למנוע השפלה של רקמת המוח החי, שהוא גורם מפתח בשמירת מצבים טובים יותר והקלטת קוצים עצביים טבעי יותר מנוירונים פעילים ברקמת המוח. שני תמונות משטח קורטיקלית, שחולצו באופן עצמאי משני מודולים הדמיה שונים, כלומר MRI ו 3d משטח הסורק תמונות, מפתיע להראות שגיאת מרחק של רק 50 יקרומטר כערך במצב של ההיסטוגרמה. דיוק זה דומה בקנה מידה לרזולוציה המיקרוסקופית של מרחקים בין-סלולאריים; כמו כן, הוא יציב בין עכברים בודדים שונים. זה פרוטוקול חדש, 3D הטבעה הרומן החופף (3D-NEO) פרוטוקול, גשרים רמות מאקרוסקופי ומיקרוסקופיים הנגזרים על ידי פרוטוקול אינטגרטיבי זה מאיץ ממצאים מדעיים חדשים כדי ללמוד ארכיטקטורות קישוריות מקיפה (כלומר, מיקרו-מחובר).
Introduction
ארכיטקטורות שאינן אחידה בארגונים פיזיים וביולוגיים שונים מצויים בדרך כלל1,2. המוח הוא גם ארגון מאוד לא אחיד ומרובה בקנה מידה של רשת3,4. פונקציות קוגניטיביות שונות מקודדים בארגוני רשת כגון, החזקת שינויים בזמן של דפוסי מסמרים חשמליים של אוכלוסיות נוירואליות ברזולוציות זמן משנה. מבחינה היסטורית, הרשתות המורכבות בין הנוירונים נצפו באופן מבנית בפרוטרוט באמצעות שיטות הצביעה של סנטיאגו רמון את קאחאל מלפני 150 שנים5. כדי לצפות בהתנהגויות קבוצתיות של נוירונים פעילים, החוקרים פיתחו טכנולוגיות הקלטה שונות6,7,8, וההתפתחויות המשמעותיות האחרונות של טכנולוגיות כאלה אפשרו לנו להקליט פעילות חשמלית ממספר עצום של נוירונים בו זמנית. יתר על כן, מתוך פעילויות תפקודית כאלה, מדענים הצליחו לשחזר רשתות של אינטראקציות סיבתי בין מספר עצום של נוירונים והכריזו על הארכיטקטורה הטופולוגית של אינטראקציות מורכבות שלהם ‘ מיקרוקישוריות ‘9 . תצפיות מקרוסקופיות של המוח מאפשרות גם לגבי מוח שלם כארגון רשת, משום שאזורי מוח רבים מחוברים באמצעות חבילות סיבים מרובים. הטבעה של מיקרו-התחברות לתוך מפת המוח הגלובלית עדיין יש מגבלות ברורות בתוך ההתקדמות הטכנולוגית הנוכחית, ולכן זה פרוטוקול הטבעה זה חשוב כל כך. עם זאת, ישנם אתגרים רבים להתפתחות של פרוטוקול ההטמעה. לדוגמה, כדי להתבונן בפעילויות של מעגלים עצביים מקומיים באזורי מוח מבודדים גרידא, יש לייצר פרוסות מוח בהקלטות של מבחנה. בנוסף, הקלטות מפרוסות מוח להקלטות של מבחנה הן עדיין בחירה חשובה לפחות שתי סיבות. ראשית, עדיין לא קל להתבונן בפעילויות של הרבה נוירונים חיים בודדים במקביל מאזורי המוח עמוק יותר ~ 1.5 מ”מ וברזולוציה הרקתית הגבוהה (< 1 אלפיות הראשונה). שנית, כאשר אנו מקווים לדעת את הארכיטקטורה הפנימית של מעגל עצבי מקומי, אנחנו צריכים להפסיק את כל התשומות המגיעים מאזורי מוח חיצוניים כדי למנוע גורמים מייסדים. כדי לזהות את ההנחיות והמיקומים של פרוסות המוח המיוצרים, יהיה צורך נוסף לשלב את המיקומים המרחביים של פרוסות המוח הללו באמצעות קואורדינטות. עם זאת, יש כמה דרכים שיטתיות ואמינות לעשות פרוסות המוח בצורה מאורגנת10,11. כאן, פרוטוקול הרישום החדש הוא הציג, באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית למחקר נוירומדעי על מנת לספק פרוטוקול אינטגרטיבי. פרוטוקול זה פועל כדי לתאם מיקרו מאזניים ולהטביע מערך רב אלקטרודה (MEA) microdata12,13 ו צביעת נתונים על מרחב MRI מאקרוסקופי באמצעות 3d לסרוק משטחים של המוח המחולצים, כמו גם של מוח שאינו מוקלט באופן בלתי פולשני. באופן מפתיע, פעולה זו הראתה שגיאת מרחק של רק ~ 50 יקרומטר כערך המצב של ההיסטוגרמה. כתוצאה מכך, ערכי המצב של מרחקים מינימליים בין שני משטחים בין משטח ה-MRI לבין משטח התלת-ממד הסרוק היו כמעט 50 יקרומטר עבור כל ששת העכברים, שהוא מספר מתאים בעת בדיקת אחידות בין אנשים. רוחב הפרוסה אופייני היה פעילות ספייק מוקלט של סביב 300 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו פרוטוקול חדש שנקרא פרוטוקול 3D-NEO לגשר מאקרוסקופי ומיקרוסקופית קשקשים מרחבית על ידי חופפים שני משטחי המוח בצורה מדויקת יותר מבעבר. במקור, היו שני אתגרים ביצירת פרוטוקול זה אשר הפכה את החפיפה המדויקת של שתי תמונות משטח המוח והקלטת פעילויות נוירואליות בריאה מאורגניזמים חיים. ראשית, ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טרשת נפוצה אסירת תודה על התמיכה של כל הצוות בקורס הנדסת מידע רפואי בבית הספר לרפואה והפקולטה לרפואה, ורוצה להודות לפרופ ‘ טטסויה טקאקווה, פרופ ‘ נובוקאטסו סורמוטו, ודוריס זקיאן לתועלת ערות. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק סיוע למחקר גישוש מאתגרת ועל ידי היוזמה המובילה לתוכנית חוקרים צעירים מצוינים (מנהיג) לטרשת נפוצה מ-MEXT (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, וטכנולוגיה). ניסויי ה-MRI בעבודה זו בוצעו בחטיבה למטרות MRI של בעלי חיים קטנים, מרכז תמיכה במחקר רפואי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת קיוטו, יפן.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
