3D scanning technologie bridging micro circuits en Macroscale hersen beelden in 3D novel insluiten overlappend Protocol
Summary
Dit artikel introduceert een experimenteel protocol met behulp van 3D-scantechnologie die twee ruimtelijke schalen overbrugt: de macroscopische ruimtelijke schaal van de anatomie van de gehele hersenen die wordt afgebeeld door een MRI op > 100 μm en de microscopische ruimtelijke schaal van neuronale verdelingen met behulp van Immunohistochemie-kleuring en een multi elektrode-array systeem en andere methoden (~ 10 μm).
Abstract
Het menselijk brein, zijnde een Multi-Scale systeem, heeft zowel macroscopische elektrische signalen, wereldwijd stroomt langs dikke witte vezelbundels, en microscopische neuronale pieken, propageren langs axonen en dendrieten. Beide weegschalen vullen verschillende aspecten van menselijke cognitieve en gedragsfuncties aan. Op macroscopisch niveau is MRI de huidige standaard beeldvormingstechnologie, waarbij de kleinste ruimtelijke resolutie, Voxel-grootte, 0,1 – 1 mm3is. Ook, op microscopisch niveau, eerdere fysiologische studies waren op de hoogte van niet-uniforme neuronale architecturen binnen dergelijke voxels. Deze studie ontwikkelt een krachtige manier om nauwkeurig microscopische gegevens in te bedden in een macroscopische kaart door interfacing biologisch wetenschappelijk onderzoek met technologische vooruitgang in 3D-scantechnologie. Aangezien 3D-scantechnologie is meestal gebruikt voor engineering en industrieel ontwerp tot nu toe, het is voorzien voor de eerste keer om microconnectomes in de hele hersenen insluiten terwijl het behoud van natuurlijke steking in levende hersencellen. Om dit doel te bereiken, hebben we eerst een scan protocol gebouwd om nauwkeurige 3D-beelden te verkrijgen van levende bio-organismen die inherent uitdagend zijn voorbeeld door vochtige en reflecterende oppervlakken. Ten tweede, we getraind om de snelheid te houden om te voorkomen dat de afbraak van levende hersenweefsel, dat is een belangrijke factor in het behoud van betere omstandigheden en het opnemen van meer natuurlijke neuronale pieken van actieve neuronen in het hersenweefsel. Twee corticale oppervlakte beelden, onafhankelijk geëxtraheerd uit twee verschillende Imaging modules, namelijk MRI en 3D scanner oppervlakte beelden, verrassend Toon een afstand fout van slechts 50 μm als modus waarde van het histogram. Deze nauwkeurigheid is vergelijkbaar in schaal met de microscopische resolutie van intercellulaire afstanden; ook is het stabiel onder verschillende individuele muizen. Dit nieuwe protocol, de 3D-roman Embedding overlappende (3D-NEO) protocol, overbrugt macroscopische en microscopische niveaus afgeleid door dit integratieve protocol en versnelt nieuwe wetenschappelijke bevindingen om uitgebreide connectiviteits architecturen te bestuderen (d.w.z. microconnectome).
Introduction
Niet-uniforme Multi-Scale architecturen op verschillende fysieke en biologische organisaties worden vaak gevonden1,2. De hersenen is ook een zeer niet-uniforme en Multi-Scale netwerkorganisatie3,4. Verschillende cognitieve functies zijn gecodeerd in dergelijke netwerk organisaties, het houden van tijdelijke veranderingen van de elektrische Spike patronen van neuronale populaties in de submilliseconde tijdelijke resoluties. Historisch gezien werden de complexe netwerken onder neuronen in detail structureel waargenomen met behulp van de kleurings technieken van Santiago Ramón y Cajal van meer dan 150 jaar geleden5. Om het groepsgedrag van actieve neuronen te observeren, hebben onderzoekers verschillende opname technologieën ontwikkeld6,7,8, en de recente belangrijke ontwikkelingen van dergelijke technologieën hebben ons in staat om op te nemen elektrische activiteiten van enorme aantallen neuronen tegelijk. Bovendien, uit dergelijke functionele activiteiten, wetenschappers zijn erin geslaagd om te reconstrueren netwerken van causale interacties tussen enorme aantallen neuronen en hebben uitgeroepen tot de topologische architectuur van hun complexe interacties ‘ microconnectome ‘9 . Macroscopische waarnemingen van de hersenen zorgen ook voor een hele hersenen als een netwerkorganisatie, omdat veel hersengebieden zijn verbonden door meerdere vezelbundels. Het insluiten van microconnectomes in de wereldwijde hersen kaart heeft nog steeds duidelijke beperkingen binnen de huidige technologische vooruitgang, daarom is dit insluitings protocol zo belangrijk. Er zijn echter veel uitdagingen voor de ontwikkeling van het insluitings protocol. Bijvoorbeeld, om activiteiten van levende lokale neuronale circuits in puur geïsoleerde hersengebieden observeren, hersenen segmenten moeten worden geproduceerd voor in vitro opnames. Bovendien zijn opnames uit hersen segmenten voor in vitro opnames nog steeds een belangrijke keuze voor ten minste twee redenen. Ten eerste is het nog steeds niet gemakkelijk om activiteiten van vele levende individuele neuronen tegelijkertijd te observeren uit hersengebieden die dieper zijn dan ~ 1,5 mm en in hoge temporele resolutie (< 1 MS). Ten tweede, wanneer we hopen te weten de interne architectuur van een lokale neuronale circuit, we moeten stoppen met alle inputs afkomstig uit externe hersengebieden om verstorende factoren te elimineren. Om de richtingen en posities van geproduceerde hersen sneden te identificeren, zal het verder nodig zijn om de ruimtelijke posities van deze geproduceerde hersen segmenten te integreren met behulp van coördinaten. Er zijn echter een paar systematische en betrouwbare manieren om hersen sneden op een georganiseerde manier te maken10,11. Hier wordt een nieuw coregistration-protocol geïntroduceerd, met behulp van 3D-scantechnologie voor neurowetenschappelijk onderzoek om een integratief protocol te bieden. Dit protocol werkt aan de coördinatie van micro-en macro weegschalen en insluiten van multi-elektrode array (MEA) microdata12,13 en kleurings gegevens op een macroscopische MRI-ruimte via 3D-scan oppervlakken van geëxtraheerde hersenen, evenals van niet-invasief opgenomen hersenen. Verrassend genoeg toonde dit een afstand fout van slechts ~ 50 μm als de modus waarde van het histogram. Als gevolg hiervan waren de modus waarden van de minimale afstanden tussen twee oppervlakken tussen het MRI-oppervlak en het gescande 3D-oppervlak bijna 50 μm voor alle zes muizen, wat een geschikt getal is bij het controleren op gemeenschappelijkheid bij individuen. De typische segment breedte had een opgenomen Spike-activiteit van ongeveer 300 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een nieuw protocol genaamd het 3D-NEO protocol om macroscopische en microscopische ruimtelijke schalen te overbruggen door twee hersen oppervlakken nauwkeuriger te overlappen dan voorheen. Oorspronkelijk waren er twee uitdagingen bij het maken van dit protocol dat de nauwkeurige overlapping van twee beelden van het hersen oppervlak mogelijk maakte en gezonde neuronale activiteiten van levende organismen vastlegt. Eerste, het was noodzakelijk om effectief te vegen snij oplossing rond de geëxtraheerde hers…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. is dankbaar voor de steun van al het personeel in de medische informatie engineering cursus in Graduate School of Medicine en Faculteit der Geneeskunde, en wil Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto en Doris Zakian bedanken voor hun nuttige Opmerkingen. Deze studie werd gesteund door een subsidie-in-Aid voor uitdagend verkennend onderzoek en door het leidende initiatief voor excellent Young onderzoekers (LEADER) programma om te M.S. van MEXT (het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie). De MRI-experimenten in dit werk werden uitgevoerd in de divisie voor kleine dierlijke MRI, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
