3D 소설 포함 프로토콜에서 마이크로 회로 및 매크로 스케일 뇌 이미지를 연결하는 3D 스캐닝 기술
Summary
이 기사에서는 두 개의 공간 척도를 연결하는 3D 스캐닝 기술을 사용하여 실험 프로토콜을 소개합니다: MRI에 의해 이미지된 전체 뇌 해부학의 거시적 공간 척도 >100 μm 및 이를 사용하는 뉴런 분포의 현미경 공간 스케일 면역히스토화학 염색 및 다중전극 어레이 시스템 및 기타 방법(~10 μm).
Abstract
다중 스케일 시스템인 인간의 뇌는 거시적 전기 신호를 모두 가지고 있으며, 전 세계적으로 두꺼운 백색 물질 섬유 번들을 따라 흐르고 있으며, 미세한 뉴런 스파이크는 축색과 모수석을 따라 전파됩니다. 두 척도 인간의 인지 및 행동 기능의 다른 측면을 보완. 거시적 수준에서 MRI는 가장 작은 공간 해상도인 복셀 크기가 0.1-1 mm3인현재의 표준 이미징 기술입니다. 또한, 현미경 수준에서, 이전 생리학 연구는 복셀 내의 불균일한 신경 구조의 알고 있었다. 이 연구는 3D 스캐닝 기술의 기술 적 진보와 생물학적 과학 연구를 상호 결합하여 미세 한 데이터를 거시적지도에 정확하게 포함시키는 강력한 방법을 개발합니다. 3D 스캐닝 기술은 지금까지 주로 엔지니어링 및 산업 설계에 사용되어 왔기 때문에 살아있는 뇌 세포에서 자연 스며드는 유지하면서 전체 뇌에 미세 커넥톰을 내장하는 데 처음으로 용도가 변경되었습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해 먼저 습하고 반사되는 표면으로 인해 이미지에 본질적으로 어려움을 겪고 있는 살아있는 생물체로부터 정확한 3D 이미지를 얻기 위한 스캐닝 프로토콜을 구축했습니다. 둘째, 우리는 살아있는 뇌 조직의 저하를 방지하기 위해 속도를 유지하기 위해 훈련, 이는 더 나은 조건을 유지하고 뇌 조직의 활성 뉴런에서 더 많은 자연 신경 스파이크를 기록하는 핵심 요소입니다. 두 개의 서로 다른 이미징 모듈, 즉 MRI 및 3D 스캐너 표면 이미지에서 독립적으로 추출된 두 개의 피질 표면 이미지는 놀랍게도 히스토그램의 모드 값으로 50 μm의 거리 오차를 보여줍니다. 이 정확도는 세포 간 거리의 현미경 해상도와 규모에 필적; 또한, 그것은 다른 개별 마우스 중 안정. 이 새로운 프로토콜, 3D 소설 포함 중첩 (3D-NEO) 프로토콜, 이 통합 프로토콜에 의해 파생 된 거시적 및 현미경 수준을 브리지 하 고 포괄적인 연결 아키텍처를 공부 하는 새로운 과학적 결과 가속화 (즉, 마이크로 커넥톰)을 클릭합니다.
Introduction
다양한 물리적 및 생물학적 조직에서 불균일한 다중 스케일 아키텍처는 일반적으로1,2. 뇌는 또한 매우 균일하고 다중규모 네트워크 조직 3,4. 다양한 인지 기능은 이러한 네트워크 조직에서 코딩되어 서브 밀리초 시간적 해상도에서 신경 인구의 전기 스파이크 패턴의 시간적 변화를 유지합니다. 역사적으로, 뉴런 들 간의 복잡한 네트워크는 150 년 전5에서 산티아고 라몬 y Cajal에 의해 염색 기술을 사용하여 구조적으로 관찰되었다. 활성 뉴런의 그룹 행동을 관찰하기 위해 연구자들은다양한 기록 기술을 개발했습니다 6,7,8,이러한 기술의 최근 중요한 발전은 우리가 기록 할 수 있게 동시에 뉴런의 거대한 숫자에서 전기 활동. 또한, 이러한 기능적 활동으로부터 과학자들은 수많은 뉴런 들 사이에서 인과 상호 작용의 네트워크를 재구성하는 데 성공했으며 복잡한 상호 작용의 위상 구조를 ‘마이크로 커넥톰’9로 선언했습니다. . 많은 두뇌 지구가 다중 섬유 묶음에 의해 연결되기 때문에 두뇌의 거시적인 관측은 또한 네트워크 조직으로 전체 두뇌에 관하여 허용합니다. 글로벌 뇌 지도에 마이크로 커넥톰을 포함시키는 것은 여전히 현재의 기술 발전 내에서 명확한 한계를 가지고 있으며, 이 때문에 이 포함 프로토콜이 매우 중요합니다. 그러나 포함 프로토콜의 개발에는 많은 과제가 있습니다. 예를 들어, 순수하게 고립 된 뇌 영역에서 살아있는 국소 신경 회로의 활동을 관찰하기 위해, 뇌 조각은 시험관 내 기록을 위해 생산될 필요가있다. 또한, 생체 외에서 기록에 대 한 뇌 조각에서 기록은 여전히 적어도 두 가지 이유로 중요 한 선택. 첫째, ~1.5 mm보다 깊은 뇌 영역과 높은 시간적 해상도 (&1 ms)에서 동시에 많은 살아있는 개별 뉴런의 활동을 관찰하는 것은 쉽지 않습니다. 둘째, 로컬 뉴런 회로의 내부 아키텍처를 알고자 할 때, 우리는 혼란스러운 요인을 제거하기 위해 외부 뇌 영역에서 오는 모든 입력을 중지해야합니다. 생성된 뇌 조각의 방향과 위치를 식별하기 위해서는 좌표를 사용하여 생성된 뇌 조각의 공간 위치를 통합하는 것이 더욱 필요합니다. 그러나, 조직 된 방법으로 뇌 조각을 만드는 몇 가지 체계적이고 신뢰할 수있는 방법이 있습니다10,11. 여기서, 통합 프로토콜을 제공하기 위해 신경 과학 연구를 위한 3D 스캐닝 기술을 사용하여 새로운 공동 등록 프로토콜이 도입된다. 이 프로토콜은 마이크로 및 매크로 스케일을 조정하고 추출 된 뇌의 3D 스캔 표면을 통해 거시적 MRI 공간에 데이터를 염색하는 다중 전극 어레이 (MEA) 마이크로 데이터 (MEA) 마이크로 데이터12및13및 염색 을 하는 역할을 합니다. 비침습적으로 기록 된 뇌. 놀랍게도, 이것은 히스토그램의 모드 값으로 ~ 50 μm의 거리 오차를 보였다. 그 결과, MRI 표면과 스캔된 3D 표면 사이의 두 표면 사이의 최소 거리의 모드 값은 6마리의 마우스 모두에 대해 거의 50 μm에 달했으며, 이는 개인 간의 공통성을 확인할 때 적합한 수치이다. 전형적인 슬라이스 폭은 약 300 μm의 스파이크 활성을 기록하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 이전보다 더 정확하게 두 개의 뇌 표면을 중첩하여 거시적 및 현미경 공간 스케일을 연결하는 3D-NEO 프로토콜이라는 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 원래, 가능한 두 개의 뇌 표면 이미지의 정확한 중첩을 만든이 프로토콜을 만드는 두 가지 도전이 있었다 살아있는 유기체에서 건강한 신경 활동을 기록. 첫째, 뇌 유기체를 손상시키지 않고 두개골에서 추출 한 후 추출 된 뇌를 둘러싼 절?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S.는 의과대학 의과대학 의학정보공학과의 모든 스태프의 성원에 감사드리며, 다카쿠와 데츠야 교수님, 사와모토 노부카쓰 교수, 도리스 자키안 교수님의 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 코멘트. 이 연구는 MEXT (문부과학성)에서 석사까지 의 외래 연구 (LEADER) 프로그램을 위한 이니셔티브와 도전적인 탐사 연구를위한 보조금 지원에 의해 지원되었습니다. 이 작품의 MRI 실험은 일본 교토대학 의학연구센터, 의학연구지원센터, 소동물MRI학과에서 수행되었습니다.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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