3D-сканирование технологии преодоления микросхем и макромасштабных изображений мозга в 3D Роман встраиваясь перекрывающихся протокол
Summary
В этой статье вводится экспериментальный протокол с использованием технологии 3D-сканирования, преодолевая две пространственные шкалы: макроскопическую пространственную шкалу анатомии всего мозга, изображенную МРТ на уровне 100 мкм, и микроскопическую пространственную шкалу нейронных распределений с использованием иммуногистохимии окрашивания и мультиэлектродной системы массива и других методов (10 мкм).
Abstract
Человеческий мозг, будучи многоразмерной системой, имеет как макроскопические электрические сигналы, глобально течет вдоль толстых бело-материволоконных волоконных пучков, так и микроскопические нейронные шипы, распространяющиеся вдоль аксонов и дендритов. Обе шкалы дополняют различные аспекты когнитивных и поведенческих функций человека. На макроскопическом уровне МРТ является современной стандартной технологией визуализации, при которой наименьшее пространственноеразрешение, размер вокселя, составляет 0,1-1 мм 3. Кроме того, на микроскопическом уровне, предыдущие физиологические исследования были осведомлены о неравномерной нейронной архитектуры в таких voxels. Это исследование разрабатывает мощный способ точного встраивания микроскопических данных в макроскопическую карту путем сопутсь биологическим научным исследованиям с технологическими достижениями в технологии 3D-сканирования. Так как технология 3D-сканирования в основном использовалась для проектирования и промышленного дизайна до сих пор, она впервые перепрофилирована для встраивания микроконнектомов во весь мозг, сохраняя при этом естественный пик в живых клетках мозга. Для достижения этой цели, во-первых, мы построили протокол сканирования для получения точных 3D-изображений из живых биоорганизмов, по своей сути сложных для изображения из-за влажных и отражающих поверхностей. Во-вторых, мы обучены держать скорость, чтобы предотвратить деградацию живой ткани мозга, что является ключевым фактором в сохранении лучших условий и записи более естественных нейрональных шипов от активных нейронов в тканях мозга. Два корковых поверхностных изображения, независимо извлеченные из двух различных модулей изображения, а именно МРТ и 3D-изображения поверхности сканера, удивительно показывают ошибку расстояния всего 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. Эта точность сопоставима по масштабу с микроскопическим разрешением межклеточных расстояний; кроме того, он стабилен среди различных отдельных мышей. Этот новый протокол, 3D-роман встраивания перекрывающихся (3D-NEO) протокол, мосты макроскопических и микроскопических уровней, полученных в этом интегративном протоколе и ускоряет новые научные выводы для изучения всеобъемлющих архитектур подключения (т.е., микроконнектом).
Introduction
Неоднородные многомасштабные архитектуры в различных физических и биологических организациях обычно встречаются1,2. Мозг также является очень неравномерной и многомасштабной сетевой организации3,4. Различные когнитивные функции закодированы в таких сетевых организациях, удерживая временные изменения электрических шипов моделей нейронных популяций в субмиллисекундных временных разрешениях. Исторически сложилось так, что сложные сети среди нейронов были структурно наблюдались в деталях с использованием методов окрашивания Сантьяго Рамон у Cajal от более чем 150 лет назад5. Для наблюдения за групповым поведением активных нейронов исследователи разработали различные технологии записи6,7,8,и последние значительные разработки таких технологий позволили нам зафиксировать электрической деятельности от огромного количества нейронов одновременно. Кроме того, благодаря такой функциональной деятельности ученым удалось реконструировать сети причинно-следственных связей между огромным числом нейронов и задекларировать топоологическую архитектуру своих сложных взаимодействий «микроконнектом»9 . Макроскопические наблюдения мозга также позволяют в отношении всего мозга, как сетевая организация, потому что многие области мозга связаны несколькими волокнами.ru. Встраивание микроконнектомов в глобальную карту мозга по-прежнему имеет явные ограничения в рамках текущих технологических достижений, поэтому этот протокол встраивания так важен. Однако перед разработкой протокола встраивания существует много проблем. Например, для того, чтобы наблюдать за активностью живых местных нейронных цепей в чисто изолированных областях мозга, мозг ломтики должны быть произведены для записи в пробирке. Кроме того, записи из ломтиков мозга для записи in vitro по-прежнему являются важным выбором по крайней мере по двум причинам. Во-первых, до сих пор нелегко наблюдать за активностью многих живых отдельных нейронов одновременно из областей мозга глубже, чем 1,5 мм, и в высоком височном разрешении (Злт;1 мс). Во-вторых, когда мы надеемся узнать внутреннюю архитектуру локальной нейронной цепи, мы должны остановить все входы, поступающие из внешних областей мозга, чтобы устранить смешанные факторы. Для того, чтобы определить направления и положения произведенных ломтиков мозга, будет дополнительно необходимо интегрировать пространственные позиции этих произведенных ломтиков мозга с помощью координат. Есть, однако, несколько систематических и надежных способов сделать мозг ломтиками в организованном порядке10,11. Здесь вводится новый протокол корегистрации, использующий технологию 3D-сканирования для нейронаучных исследований, чтобы обеспечить интегративный протокол. Этот протокол действует для координации микро- и макромасштабов и встраивания мультиэлектродных массивов (МЭА) микроданных12,13 и окрашивания данных на макроскопическое пространство МРТ через 3D-сканирование поверхностей извлеченных мозгов, а также неинвазивно записанный мозг. Удивительно, но это показало погрешность расстояния всего в 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. В результате значения режима минимальных расстояний между двумя поверхностями между поверхностью МРТ и отсканированной 3D-поверхностью составляли почти 50 мкм для всех шести мышей, что является подходящим числом при проверке общности среди людей. Типичная ширина среза имела зарегистрированную активность шипа около 300 мкм.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали новый протокол под названием 3D-NEO протокол для преодоления макроскопических и микроскопических пространственных масштабах путем перекрытия двух поверхностей мозга более точно, чем раньше. Первоначально, было две проблемы в создании этого протокола, который сделал возм…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
М.С. благодарен за поддержку со стороны всего персонала в медицинской информации инженерного курса в Высшей школе медицины и факультета медицины, и хочет поблагодарить профессора Tetsuya Такакува, профессор Нобукацу Савамото, и Дорис Закян за их полезность Комментарии. Это исследование было поддержано Грант-в-помощь для сложных исследований исследований и ведущей инициативы для превосходных молодых исследователей (LEADER) программы м.с. от MEXT (Министерство образования, культуры, спорта, науки и технологии). Эксперименты МРТ в этой работе были проведены в Отделе МРТ малых животных, Центре медицинской поддержки, Высшей школе медицины, Киотском университете, Япония.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
