Tecnología de escaneo 3D Bridging Microcircuits e Macroscale Brain Images en 3D Novel Embedding Overlapping Protocol
Summary
Este artículo presenta un protocolo experimental que utiliza la tecnología de escaneo 3D que une dos escalas espaciales: la escala espacial macroscópica de la anatomía de todo el cerebro fotográfica a >100 m y la escala espacial microscópica de las distribuciones neuronales utilizando inmunohistoquímica y un sistema de matriz de multielectrodos y otros métodos (10 m).
Abstract
El cerebro humano, al ser un sistema multiescala, tiene señales eléctricas macroscópicas, que fluyen globalmente a lo largo de gruesos haces de fibra de materia blanca, y picos neuronales microscópicos, que se propagan a lo largo de axónes y dendritas. Ambas escalas complementan diferentes aspectos de las funciones cognitivas y conductuales humanas. A nivel macroscópico, la RMN ha sido la tecnología de imagen estándar actual, en la quela resolución espacial más pequeña, el tamaño de los vóxeles, es de 0,1-1 mm 3. Además, a nivel microscópico, estudios fisiológicos previos eran conscientes de las arquitecturas neuronales no uniformes dentro de estos vóxeles. Este estudio desarrolla una poderosa manera de integrar con precisión los datos microscópicos en un mapa macroscópico mediante la interconexión de la investigación científica biológica con los avances tecnológicos en la tecnología de escaneo 3D. Dado que la tecnología de escaneo 3D se ha utilizado principalmente para la ingeniería y el diseño industrial hasta ahora, se reutiliza por primera vez para incrustar microconnectomes en todo el cerebro mientras se preserva el pico natural en las células cerebrales vivas. Para lograr este propósito, primero, construimos un protocolo de escaneo para obtener imágenes 3D precisas de bioorganismos vivos inherentemente desafiantes a la imagen debido a superficies húmedas y reflectantes. En segundo lugar, nos entrenamos para mantener la velocidad para prevenir la degradación del tejido cerebral vivo, que es un factor clave en la retención de mejores condiciones y el registro de picos neuronales más naturales de las neuronas activas en el tejido cerebral. Dos imágenes de superficie cortical, extraídas independientemente de dos módulos de imágenes diferentes, a saber, imágenes de rmny y de superficie del escáner 3D, muestran sorprendentemente un error de distancia de sólo 50 m como valor de modo del histograma. Esta precisión es comparable en escala a la resolución microscópica de distancias intercelulares; también, es estable entre diferentes ratones individuales. Este nuevo protocolo, el nuevo protocolo 3D que incorpora la superposición (3D-NEO), une los niveles macroscópicos y microscópicos derivados de este protocolo integrador y acelera los nuevos hallazgos científicos para estudiar arquitecturas de conectividad integrales (es decir, microconecto).
Introduction
Las arquitecturas multiescala no uniformes en variasorganizaciones físicas y biológicas se encuentran comúnmente 1,2. El cerebro es también una organización de red muy no uniforme y multiescala3,4. Varias funciones cognitivas se codifican en tales organizaciones de la red, manteniendo cambios temporales de patrones de picos eléctricos de poblaciones neuronales en resoluciones temporales de submilisegundos. Históricamente, las complejas redes entre las neuronas se observaron estructuralmente en detalle utilizando las técnicas de tinción de Santiago Ramón y Cajal de hace más de 150 años5. Para observar los comportamientos grupales de las neuronas activas, los investigadores han desarrollado varias tecnologías de grabación6,7,8, y los recientes desarrollos significativos de estas tecnologías nos han permitido registrar actividades eléctricas de un gran número de neuronas simultáneamente. Además, a partir de estas actividades funcionales, los científicos han logrado reconstruir redes de interacciones causales entre un gran número de neuronas y han declarado la arquitectura topológica de sus complejas interacciones ‘microconnectome’9 . Observaciones macroscópicas del cerebro también permiten considerar todo un cerebro como una organización de red porque muchas regiones cerebrales están conectadas por múltiples paquetes de fibra. La incorporación de microconectos en el mapa cerebral global todavía tiene limitaciones claras dentro de los avances tecnológicos actuales, por lo que este protocolo de incrustación es tan importante. Sin embargo, hay muchos desafíos para el desarrollo del protocolo de inserción. Por ejemplo, con el fin de observar las actividades de los circuitos neuronales locales vivos en regiones cerebrales puramente aisladas, las rebanadas de cerebro deben ser producidas para las grabaciones in vitro. Además, las grabaciones de rebanadas cerebrales para grabaciones in vitro siguen siendo una opción importante por al menos dos razones. En primer lugar, todavía no es fácil observar las actividades de muchas neuronas individuales vivas simultáneamente desde regiones cerebrales más profundas que 1,5 mm y en alta resolución temporal (<1 ms). En segundo lugar, cuando esperamos conocer la arquitectura interna de un circuito neuronal local, necesitamos detener todas las entradas procedentes de regiones cerebrales externas para eliminar los factores de confunción. Con el fin de identificar las direcciones y posiciones de las rebanadas cerebrales producidas, será necesario integrar las posiciones espaciales de estas rebanadas cerebrales producidas utilizando coordenadas. Hay, sin embargo, algunas formas sistemáticas y confiables de hacer rebanadas cerebrales de una manera organizada10,11. Aquí, se introduce un nuevo protocolo de registro de coregistro, utilizando tecnología de escaneo 3D para la investigación neurocientífica con el fin de proporcionar un protocolo integrador. Este protocolo actúa para coordinar micro y macroescalas e incrustar microdatos de matriz de multielectrodos (MEA)12,13 y tinción de datos en un espacio de RMN macroscópico a través de superficies de exploración 3D de cerebros extraídos, así como de cerebros no registrados de manera no invasiva. Sorprendentemente, esto mostró un error de distancia de sólo 50 m como el valor de modo del histograma. Como resultado, los valores de modo de distancias mínimas entre dos superficies entre la superficie de RMN y la superficie 3D escaneada eran de casi 50 m para los seis ratones, lo que es un número adecuado al comprobar la uniformidad entre los individuos. El ancho típico de la rebanada tenía una actividad de pico registrada de alrededor de 300 m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un nuevo protocolo llamado protocolo 3D-NEO para unir escalas espaciales macroscópicas y microscópicas superponiendo dos superficies cerebrales con mayor precisión que antes. Originalmente, había dos desafíos en la creación de este protocolo que hizo posible la superposición precisa de dos imágenes de la superficie del cerebro y el registro de actividades neuronales saludables de organismos vivos. En primer lugar, era necesario limpiar eficazmente la solución de corte que rodea el cerebro extraído…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. agradece el apoyo de todo el personal en el curso de ingeniería de información médica en la Escuela de Posgrado de Medicina y Facultad de Medicina, y quiere agradecer a la Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, y Doris Zakian por su útil Comentarios. Este estudio fue apoyado por una Beca en Ayuda para la Investigación Exploratoria Desafiante y por el programa Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) a M.S. from MEXT (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología). Los experimentos de RMN en este trabajo se realizaron en la División de RMN de Animales Pequeños, Centro de Apoyo a la Investigación Médica, Escuela de Medicina de Posgrado, Universidad de Kioto, Japón.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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