3D tarama teknolojisi köprüleme mikrodevreler ve Macroscale beyin görüntüleri 3D roman gömme çakışan protokol
Summary
Bu makalede, iki uzamsal ölçekler köprüleme 3D tarama teknolojisi kullanarak deneysel bir protokol tanıttı: MRG tarafından > 100 μm olarak görüntülenmiş tüm beyin anatomisinin makroskopik uzamsal ölçeği ve nöronal dağılımları kullanarak mikroskobik uzamsal ölçek immunohistokimya boyama ve multielektrot dizi sistemi ve diğer Yöntemler (~ 10 μm).
Abstract
İnsan beyni, çok ölçekli sistemi olan, hem makroskopik elektrik sinyalleri, küresel kalın beyaz madde elyaf demetleri boyunca akan, ve mikroskopik nöronal sivri, akons ve dendrites boyunca yayılıyor. Her iki ölçek insan bilişsel ve davranışsal fonksiyonların farklı yönlerini tamamlar. Makroskopik düzeyde MRG, en küçük uzamsal çözünürlüğün, Voksel boyutunun 0,1 – 1 mm3olduğu mevcut standart görüntüleme teknolojisi olmuştur. Ayrıca, mikroskobik düzeyde, önceki fizyolojik çalışmalar bu tür voxels içinde eşit olmayan nöronal mimariler farkındayız. Bu çalışmada, 3D tarama teknolojisindeki teknolojik gelişmeler ile biyolojik bilimsel araştırmalarla arabirim yaparak mikroskobik verileri makroskopik bir haritaya doğru bir şekilde katıştırmak için güçlü bir yol gelişir. 3D tarama teknolojisi çoğunlukla mühendislik ve endüstriyel tasarım için şimdiye kadar kullanılmış olduğundan, ilk kez canlı beyin hücrelerinde doğal spiking korurken tüm beyin içine microconnectomes katıştırmak için repurposed. Bu amaca ulaşmak için, ilk olarak, nemli ve yansıtıcı yüzeyler nedeniyle görüntü için doğal olarak zorlu yaşam biyo-organizmaların doğru 3D görüntüleri elde etmek için bir tarama protokolü inşa ettik. İkinci olarak, biz daha iyi koşullar koruyarak ve beyin dokusunda aktif nöronların daha doğal nöronal sivri kayıt önemli bir faktördür yaşam beyin dokusu, bozulması önlemek için hız tutmak için eğitildi. İki kortikal yüzey görüntüleri, bağımsız olarak iki farklı görüntüleme modülleri, yani MRI ve 3D tarayıcı yüzey görüntüleri, şaşırtıcı bir mesafe hatası gösteren sadece 50 μm histogram modu değeri olarak ayıklanır. Bu doğruluk, hücre içi mesafelerin mikroskobik çözünürlüğüne Ölçekle karşılaştırılabilir; Ayrıca, farklı bireysel fareler arasında kararlı. Bu yeni protokol, çakışan (3D-NEO) protokol katıştırma 3D roman, bu entegratif protokol tarafından türetilen makroskopik ve mikroskobik seviyeleri köprüler ve kapsamlı bağlantı mimarileri (i.e., çalışma için yeni bilimsel bulgular hızlandırır microconnectome).
Introduction
Çeşitli fiziksel ve biyolojik kuruluşlarda bulunan çok ölçekli mimarileri genellikle1,2‘ de bulunur. Beyin aynı zamanda çok eşit olmayan ve çok ölçekli ağ organizasyon3,4. Çeşitli bilişsel fonksiyonlar, bu tür ağ kuruluşlarında kodlanmış, submillisecond temporal çözünürlüklerde nöronal nüfus elektrik başak desenleri temporal değişiklikler tutarak. Tarihsel olarak, nöronlar arasında karmaşık ağlar yapısal ayrıntılı olarak Santiago Ramón y Cajal tarafından 150 yıl önce5‘ ten itibaren boyama teknikleri kullanılarak gözlenmiştir. Aktif nöronların grup davranışlarını gözlemlemek için, araştırmacılar çeşitli kayıt teknolojileri geliştirdik6,7,8, ve bu tür teknolojilerin son önemli gelişmeler bize kayıt sağladı aynı anda çok sayıda nöronların elektrik faaliyetleri. Ayrıca, bu tür işlevsel etkinliklerden, bilim adamları, nöronların çok sayıda arasındaki nedensel etkileşimlerin ağları yeniden inşa etmeye başardı ve karmaşık etkileşimleri ‘ microconnectome ‘ 9 topolojik mimarisi ilan ettiler . Birçok beyin bölgeleri birden fazla Fiber-demetleri ile bağlı çünkü beynin makroskopik gözlemler de bir ağ organizasyonu olarak bir bütün beyin ile ilgili izin verir. Microconnectomes küresel beyin haritası içine gömme hala mevcut teknolojik gelişmeler içinde açık sınırlamalar vardır, bu yüzden bu gömme protokol çok önemlidir. Ancak, gömme protokolünün geliştirilmesi için birçok zorluk vardır. Örneğin, tamamen yalıtılmış beyin bölgelerinde yerel nöronal devrelerin yaşam etkinliklerini gözlemlemek için, beyin dilimleri in vitro kayıtlar için üretilmesi gerekir. Ayrıca, in vitro kayıtlar için Beyin dilimleri kayıtları hala en az iki nedenden dolayı önemli bir seçimdir. İlk olarak, beyin bölgelerinden ~ 1,5 mm ‘den daha derin ve yüksek temporal çözünürlükte (< 1 MS) aynı anda birçok yaşam bireysel nöronların faaliyetlerini gözlemlemek kolay değildir. İkinci olarak, yerel bir nöronal devrenin iç mimarisini bilmeyi umduğunuzda, dış beyin bölgelerinden gelen tüm girişleri, karıştıran faktörleri ortadan kaldırmak için durdurmak gerekir. Yol tarifi ve üretilen Beyin dilimleri konumlarını belirlemek için, bu koordinatları kullanarak bu üretilen Beyin dilimleri uzamsal pozisyonları entegre etmek daha gerekli olacaktır. Ancak, organize bir şekilde beyin dilimleri yapmak için birkaç sistematik ve güvenilir yolları vardır10,11. Burada, Integrative protokol sağlamak için nörobilimsel araştırma için 3D tarama teknolojisini kullanarak yeni bir coregistration Protokolü tanıtıldı. Bu protokol, mikro ve makroölçekleri koordine etmek ve multielektrot dizisi (MEA) mikro veriler12,13 ve boyama verilerini, ayıklanan beynin 3D tarama yüzeyleriyle makroskopik MRG alanına yerleştirecek şekilde davranır, ayrıca noninvazif beyin kaydedildi. Şaşırtıcı bir şekilde, Bu histogram mod değeri olarak sadece ~ 50 μm bir mesafe hatası gösterdi. Sonuç olarak, MRI yüzeyi ile taranan 3B yüzey arasındaki iki yüzey arasındaki minimum mesafelerin mod değerleri, bireyler arasında ortak denetim yaparken uygun bir sayı olan altı fareler için yaklaşık 50 μm idi. Tipik dilim genişliği 300 μm civarında kaydedilmiş bir başak aktivitesine sahipti.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki beyin yüzeyinden daha doğru bir şekilde örtüşerek makroskopik ve mikroskobik uzamsal ölçekleri köprüleyerek 3D-NEO protokolü olarak adlandırılan yeni bir protokol geliştirdik. Aslen, iki beyin yüzeyi görüntülerinin doğru şekilde örtüşmesini ve canlı organizmalardan sağlıklı nöronal faaliyetleri kaydetmesi mümkün kılan bu protokolü oluştururken iki zorluk vardı. İlk olarak, etkili bir şekilde beyin organizması (adım 6,2 protokol) yaralanmadan kafatası ayıkladıktan sonra çıka…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S., Tıp Bilimleri Fakültesi ve Tıp fakültesinde tıbbi bilgi Mühendisliği dersinde bulunan tüm personelden destek için minnettar ve yardımcı oldukları için Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto ve Doris Zakian ‘a teşekkür etmek istiyor Yorum. Bu çalışmada, zorlu araştırmacı araştırmalar için Grant-ın-Aid ve MEXT (eğitim, kültür, spor, bilim ve Teknoloji Bakanlığı) ‘ dan M.S. mükemmel genç araştırmacılar (LEADER) programının önde gelen girişimi tarafından destekleniyordu. Bu çalışmanın MRG denemeleri küçük hayvan MRG, tıbbi araştırma Destek Merkezi, Tıp Enstitüsü, Kyoto Üniversitesi, Japonya için bölüm ‘de gerçekleştirildi.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
