La tecnologia di scansione 3D che sposa microcircuiti e immagini cerebrali su macro in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol
Summary
Questo articolo introduce un protocollo sperimentale utilizzando la tecnologia di scansione 3D che collega due scale spaziali: la scala spaziale macroscopica dell’anatomia dell’intero cervello immagine della risonanza magnetica a >100 m e la scala spaziale microscopica delle distribuzioni neuronali utilizzando colorazione immunohistochimica e un sistema di array multielettrodi e altri metodi (10 m).
Abstract
Il cervello umano, essendo un sistema multiscala, ha sia segnali elettrici macroscopici, che scorrono globalmente lungo spessi fasci di fibre di materia bianca, sia microscopici picchi neuronali, che si propagano lungo assoni e dendriti. Entrambe le scale completano diversi aspetti delle funzioni cognitive e comportamentali umane. A livello macroscopico, la risonanza magnetica è stata l’attuale tecnologia di imaging standard, in cui la più piccola risoluzione spaziale, la dimensione del voxel, è di 0,1-1 mm3. Inoltre, a livello microscopico, precedenti studi fisiologici erano consapevoli di architetture neuronali non uniformi all’interno di tali voxel. Questo studio sviluppa un modo efficace per incorporare accuratamente i dati microscopici in una mappa macroscopica interfacciando la ricerca scientifica biologica con i progressi tecnologici nella tecnologia di scansione 3D. Dal momento che la tecnologia di scansione 3D è stata utilizzata principalmente per l’ingegneria e la progettazione industriale fino ad ora, è stata riproposta per la prima volta per incorporare microconnettomi in tutto il cervello, preservando i picchi naturali nelle cellule cerebrali viventi. Per raggiungere questo scopo, in primo luogo, abbiamo costruito un protocollo di scansione per ottenere immagini 3D accurate da bio-organismi viventi intrinsecamente difficili da immaginare a causa di superfici umide e riflettenti. In secondo luogo, abbiamo addestrato a mantenere la velocità per prevenire la degradazione del tessuto cerebrale vivente, che è un fattore chiave per mantenere condizioni migliori e la registrazione di picchi neuronali più naturali dai neuroni attivi nel tessuto cerebrale. Due immagini di superficie corticali, estratte in modo indipendente da due diversi moduli di imaging, vale a dire immagini di superficie rm . Questa precisione è paragonabile in scala alla risoluzione microscopica delle distanze intercellulari; inoltre, è stabile tra diversi topi singoli. Questo nuovo protocollo, il nuovo protocollo 3D che incorpora la sovrapposizione (3D-NEO), collega i livelli macroscopici e microscopici derivati da questo protocollo integrativo e accelera nuove scoperte scientifiche per studiare architetture di connettività complete (cioè, ponti microcongela).
Introduction
Architetture multiscala non uniformi in varie organizzazioni fisiche e biologiche si trovano comunemente1,2. Il cervello è anche un’organizzazione di rete molto non uniforme e multiscala3,4. Varie funzioni cognitive sono codificate in tali organizzazioni di rete, tenendo cambiamenti temporali dei modelli di picco elettrici delle popolazioni neuronali in risoluzioni temporali submillisecondi. Storicamente, le reti complesse tra i neuroni sono state strutturalmente osservate in dettaglio utilizzando le tecniche di colorazione di Santiago Ramàn y Cajal da oltre 150 anni fa5. Per osservare i comportamenti di gruppo dei neuroni attivi, i ricercatori hanno sviluppato varie tecnologie di registrazione6,7,8, e i recenti sviluppi significativi di tali tecnologie ci hanno permesso di registrare attività elettriche da un numero enorme di neuroni contemporaneamente. Inoltre, da tali attività funzionali, gli scienziati sono riusciti a ricostruire reti di interazioni causali tra un numero enorme di neuroni e hanno dichiarato l’architettura topologica delle loro complesse interazioni ‘microconconnectoma’9 . Osservazioni macroscopiche del cervello consentono anche per quanto riguarda un intero cervello come un’organizzazione di rete, perché molte regioni del cervello sono collegati da più fibre-bundle. L’incorporazione di microconsomi nella mappa cerebrale globale ha ancora chiare limitazioni all’interno degli attuali progressi tecnologici, motivo per cui questo protocollo di incorporamento è così importante. Tuttavia, ci sono molte sfide per lo sviluppo del protocollo di incorporamento. Per esempio, al fine di osservare le attività di circuiti neuronali locali viventi in regioni del cervello puramente isolate, le fette di cervello devono essere prodotte per le registrazioni in vitro. Inoltre, le registrazioni da fette di cervello per le registrazioni in vitro sono ancora una scelta importante per almeno due motivi. In primo luogo, non è ancora facile osservare le attività di molti singoli neuroni viventi contemporaneamente da regioni cerebrali più profonde di 1,5 mm e in alta risoluzione temporale (<1 ms). In secondo luogo, quando speriamo di conoscere l'architettura interna di un circuito neuronale locale, dobbiamo fermare tutti gli input provenienti da regioni cerebrali esterne per eliminare i fattori di confusione. Al fine di identificare le direzioni e le posizioni delle fette di cervello prodotte, sarà ulteriormente necessario integrare le posizioni spaziali di queste fette di cervello prodotte utilizzando le coordinate. Ci sono, tuttavia, alcuni modi sistematici e affidabili per fare fette di cervello in modo organizzato10,11. Qui viene introdotto un nuovo protocollo di coregistrazione, utilizzando la tecnologia di scansione 3D per la ricerca neuroscientifica al fine di fornire un protocollo integrativo. Questo protocollo agisce per coordinare micro e macroscale e incorporare i microdati MEA (multielettrode array)12,13 e i dati di colorazione su uno spazio di risonanza magnetica macroscopico attraverso superfici di scansione 3D di cervelli estratti, cervelli non registrati in modo invasivo. Sorprendentemente, questo ha mostrato un errore di distanza di soli 50 dollari come valore di modalità dell’istogramma. Di conseguenza, i valori di modalità delle distanze minime tra due superfici tra la superficie della risonanza magnetica e la superficie 3D scansionata erano quasi 50 m per tutti e sei i topi, il che è un numero adatto durante il controllo della comunanza tra gli individui. La larghezza tipica della fetta ha avuto un’attività di picco registrata di circa 300 m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo chiamato protocollo 3D-NEO per colmare scale spaziali macroscopiche e microscopiche sovrapponendo due superfici cerebrali in modo più accurato rispetto a prima. Originariamente, c’erano due sfide nella creazione di questo protocollo che ha reso possibile la sovrapposizione accurata di due immagini di superficie del cervello e la registrazione di attività neuronali sane da organismi viventi. In primo luogo, è stato necessario pulire efficacemente la soluzione di taglio che circond…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. è grata per il supporto di tutto il personale nel corso di ingegneria dell’informazione medica presso la Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, e vuole ringraziare il professor Tetsuya Takakuwa, il prof. Commenti. Questo studio è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa impegnativa e dal programma Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) a M.S. da MEXT (The Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology). Gli esperimenti di risonanza magnetica in questo lavoro sono stati eseguiti nella Divisione per la risonanza magnetica dei piccoli animali, Centro di supporto per la ricerca medica, Graduate School of Medicine, Università di Kyoto, Giappone.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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