カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査
Summary
ここでは、余分なフラックス アナライザーを使用してミトコンドリア呼吸とカンジダで解糖系の機能を調査するための段階的なプロトコルを提示します。
Abstract
ミトコンドリアは、細胞の代謝と生存の重要な細胞内小器官です。ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシスなどのさまざまな主要なイベントが起こる。その結果、ミトコンドリア機能障害とされる抗真菌薬耐性と病原菌の病原性に重要な役割を果たします。最近のデータは真菌の病原性に重要な貢献としてミトコンドリアの重要性の認識にもつながっています。真菌の生物学におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらずその機能を理解する標準化された方法の発達は悪い。基底酸素消費量 (OCR) ミトコンドリア呼吸の測定と細胞の酸性化率 (ecar と)、 C. albicans系統における解糖系機能の測定を研究するための手順を紹介します。記載方法は、そのまま真菌細胞からミトコンドリアを浄化することがなく任意のサーベイランス。系統に適用できます。さらに、このプロトコルをカスタマイズすることができますc. アルビカンス菌のミトコンドリア機能阻害剤の画面に。
Introduction
侵襲性真菌感染症は、世界中で毎年以上 150 万人を殺します。この番号は、侵害された免疫は、高齢者、未熟児、移植、癌患者1などとともに生きる人々 の数の増加による上昇には。C. アルビカンスは人間の細菌叢の一部である日和見人間真菌の菌です。また、粘膜の表面や消化管が共生生物として生息します。C. アルビカンスは、免疫不全症、手術を受けている人や長期の抗生物質のコースと扱われている人を持っている人に深刻な全身疾患を生成します。院内感染症 (NID) 人間2,3,4,5,6、7のトップ 3 〜 4 原因のうちカンジダ種のランク。カンジダ血流感染症の年間の世界的な数は、~ 400,000 症例 46 751の関連付けられている死亡すると推定されます。カンジダ症のための年間死亡率はほぼ単独で米国で 10,000 です。菌類が原因で NID の程度も、天文学的な患者費用5に反映されます。アメリカ合衆国では、侵襲性真菌感染症の治療のための年次費用は $ 20 億、すでに負担医療システムに大きな負担を追加するを上回っています。現在、利用可能な標準的抗真菌治療は毒性、ますます普及している薬剤耐性、および薬物-薬物相互作用により制限されています。したがって、ハイリスク患者に対するより良い治療の選択肢になります新しい抗真菌薬のターゲットを識別するために緊急の必要性があります。しかし、菌は真核生物であるために、真菌ターゲットに作用する新薬の発見は複雑です。これは大きく真菌特定薬剤ターゲットの数を制限します。
最近の研究は、ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシス8 の重要なので、ミトコンドリアが耐性抗真菌薬と真菌の病原性に重要な貢献こと示されています。 ,9,10,11。解糖系と非解糖系代謝は、哺乳類のホスト12,13,14,,1516 C. albicansの生存に不可欠です。さらに、Goa1 などのミトコンドリア蛋白質に欠けているいくつかのc. アルビカンス変異 Srr1 Gem1 Sam37 等が示されている粘い、 C. albicans17,の重要な病原因子の欠陥18,19,20,21,22しますさらに、これらの変異体も示したマウス モデルにおける病原性播種性カンジダ症17,18,19,20,21 の減衰させる。 ,22。つまり、菌のミトコンドリアは、創薬のための魅力的なターゲットを表します。ただし、 C. albicansは小柄な負23、それがミトコンドリアのゲノムことがなく生き残ることはできませんを意味するためにC. albicansのミトコンドリア機能に関する研究が困難します。
ここでは、ミトコンドリアを浄化するために必要とせずC. albicansのミトコンドリアと解糖系の機能を調査するために使用することができますプロトコルについて述べる。このメソッドは、 C. albicansのミトコンドリアと解糖系の経路の遺伝的操作や化学物質の変調器の効果を調べるためも最適化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体エネルギー酸化的リン酸化 (OXPHOS) を測定することによってミトコンドリアの機能を読み出すための優れたツールとして余分なフラックスの試金-リアルタイム依存酸素消費量。また、リアルタイム解析で同時に細胞の酸性化率 (細胞外 pH の変更) として測定される解糖系関数を調べることがもできます。
アッセイ プレートでC. albicansの成功したメッキは、ため?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NC ラボで研究をサポートするには、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01AI24499 とニュージャージー州健康財団 (NJHF) の助成金、#PC40 18。
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
