Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis
Summary
Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.
Abstract
Las mitocondrias son organelos esenciales para el metabolismo celular y la supervivencia. Una variedad de eventos clave llevará a cabo en la mitocondria, como la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis. En consecuencia, la disfunción mitocondrial se divulga a jugar un papel importante en la tolerancia de antimicóticos y la virulencia de hongos patógenos. Datos recientes también han contribuido al reconocimiento de la importancia de la mitocondria como un contribuyente importante para la patogénesis fúngica. A pesar de la importancia de la mitocondria en biología fúngica, métodos estandarizados para entender su función están poco desarrollados. Aquí, presentamos un procedimiento para estudiar la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), una medida de la respiración mitocondrial y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), una medida de la función glucolisis en cepas de C. albicans . El método descrito en este documento puede aplicarse a cualquier Candidaspp. cepas sin la necesidad de purificar las mitocondrias de las células fúngicas intactas. Además, este protocolo puede también ser modificado para requisitos particulares para detectar inhibidores de la función mitocondrial en cepas de C. albicans .
Introduction
Las infecciones fúngicas invasivas mata a más 1,5 millones de personas al año en todo el mundo. Este número va en aumento debido a un aumento en el número de personas con inmunidad comprometida, incluyendo los bebés prematuros, ancianos, trasplantados y cáncer pacientes1. C. albicans es un hongo patógeno humano oportunista que es una parte de la microflora humana. También habita las superficies mucosas y el tracto gastrointestinal como un organismo comensal. C. albicans produce enfermedad sistémica seria en personas con inmunodeficiencias, que han sometido a cirugía o que han sido tratados con cursos largos de antibióticos. El rango de especies de Candida entre las causas de la tapa tres de las enfermedades infecciosas nosocomiales (NID) en los seres humanos2,3,4,5,6,7. Se estima el número global de infecciones de la sangre de Candida ~ 400.000 casos, con mortalidad asociada de 46-75%1. La mortalidad anual a causa de la candidiasis es de aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos. El grado de NID causada por hongos también se refleja en gastos astronómicos de paciente5. En los Estados Unidos, el gasto anual para el tratamiento de las infecciones fúngicas invasivas supera los $ 2 billones, añadiendo una gran tensión al sistema de salud ya sobrecargado. En la actualidad, terapias antihongos estándar disponibles son limitadas debido a toxicidad, resistencia a los medicamentos cada vez más frecuentes y las interacciones de fármacos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas dianas de antimicóticos que se traducirá en mejores opciones de tratamiento para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos fármacos que actúan sobre dianas fúngicas es complicado porque los hongos son eucariotas. Grandemente, esto limita el número de dianas farmacológicas de fungicidas específicos.
Estudios recientes han indicado que las mitocondrias son un contribuyente fundamental a la virulencia de hongos y la tolerancia a drogas antihongos ya que las mitocondrias son importantes para la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico y no glucolisis son esenciales para la supervivencia de C. albicans en el huésped mamífero12,13,14,15,16. Además, varios mutantes de C. albicans que carece de proteínas mitocondriales, como la Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. han demostrado ser defectuoso en la filamentación, un factor importante de virulencia de C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Además, estos mutantes también fueron demostrados para ser atenuada para difusión de virulencia en un modelo murino de candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Así, las mitocondrias hongos representan un atractivo destino para el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, el estudio de la función mitocondrial en C. albicans es difícil debido a que C. albicans es petite negativa23, que significa que no puede sobrevivir sin el genoma mitocondrial.
Aquí, describimos un protocolo que puede utilizarse para investigar la función mitocondrial y glucolisis en C. albicans sin necesidad de purificar las mitocondrias. Este método también se puede optimizar para investigar el efecto de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolisis en C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
La bioenergética análisis de flujo extra sirven como una excelente herramienta para leer la función mitocondrial mediante la medición de fosforilación oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxígeno dependiente en tiempo real. Además, una función de glucolisis que es medida como una tasa de acidificación extracelular (cambio en el pH extracelular) también se puede investigar al mismo tiempo en el análisis en tiempo real.
Exitosa siembra de C. albicans en la placa de ensayo es uno de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en laboratorio de NC es apoyada por una subvención de los institutos nacionales de salud (NIH) R01AI24499 y una beca de la Fundación de salud de Nueva Jersey (NJHF), #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
