Här presenterar vi ett protokoll för att utföra bärbara cellulära aerosol exponeringar och mäta cellulära svar. Metoden använder celler, odlas på gränssnittet luft-vätska, härma i vivo fysiologi. Cellulär respons koppar nanopartiklar aerosoler observerades som oxidativ stress genom reaktivt syre arter generering och cytotoxicitet som laktatdehydrogenas release.
Detta protokoll införs ett nytt in vitro- exponering system, kan bärs, inklusive dess karakterisering och prestanda. Luft-vätska gränssnitt (ALI) in vitro- exponering system är ofta stora och skrymmande, försvårar transport till fältet och drift vid källan av utsläpp eller inom andningszonen. Genom miniatyrisering av dessa system, kan labbet föras till fältet, påskynda handläggningstiden och att tillhandahålla en mer lämplig exponeringsmetod som inte ändrar Aerosolen innan du kontaktar cellerna. Bärbart In vitro exponering kassett (PIVEC) anpassar en 37 mm filter kassett för in vitro- toxicitetstester utanför traditionella laboratoriemiljö. PIVEC präglades använder tre storlekar av koppar nanopartiklar för att bestämma nedfall effektivitet utifrån gravimetrisk och partikelanalys nummer koncentration. Inledande cytotoxicitet experimenten utfördes med exponerade lungceller att bestämma systemets förmåga att sätta in partiklar samtidigt som cellernas viabilitet. PIVEC ger en liknande eller ökade nedfall effektivitet när jämförande till tillgängliga vinkelrätt flöde in vitro exponering-enheter. Trots den lägre provmängder ger den lilla storleken några fördelar till den nuvarande in vitro- ALI exponering system. Dessa inkluderar möjligheten att bäras under personlig övervakning, rörlighet från laboratoriet till källan till utsläpp och möjlighet att ställa upp flera system för rumslig upplösning samtidigt en lägre användare kostar. PIVEC är ett system som kan samla in aerosoler i fältet och inom andningszonen på en air-ihop, in vitro- modell.
Personliga provtagning med in vitro- metoder kan ge omfattande information om de biologiska effekterna av aerosoler på arbetsplatsen. 1 exponeringar mot föroreningar i luften omfatta exponeringar mot kemiskt själv, att de insamlade luftprover, nedsänkt villkor där gasen introduceras till cellsuspension, intermittent exponering med hjälp av en enhet såsom en rocker, eller direkt exponeringar vid luft-vätska gränssnitt (ALI). 2 många av dessa tekniker utförs med celler odlas i suspension eller provtagning före exponering, som alla kan påverka toxikologiska studien på grund av potentiella förändringar i aerosoler. 3 för att undvika dessa förändringar, laboratoriet kan föras till fältet med hjälp av flera in vitro- ALI kultur exponering system som används i litteratur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 dock få är kommersiellt tillgängliga. 8 , 9 , 12 dessa system är ofta skrymmande, särskilt när inklusive instrument för att reglera temperatur och luftfuktighet på den cellulära miljön och flödet klassar av provet aerosoler. Med hjälp av PIVEC, kan aerosol exponeringar utföras utanför en traditionell lab miljö eller inom andningszonen medan härma inandning villkor.
Bestämning av aerosol nedfall i vitro är viktigt att utredningen av hälsoeffekter på grund av inandning. Andningszonen, området inom 30 cm från munnen och näsan,14 är avgörande för att förstå exponering för nanopartiklar och för att länka till de biologiska effekterna i lungorna. 2 ofta, nedfall på celler definieras som ett nedfall effektivitet, partiklarna deponeras på och tas upp av cellerna dividerat med partiklarna administreras till systemet6,15 eller på en massa bas av samma belopp. 4 , 16 de nuvarande metoderna för mätning av aerosoler i andningszonen är filter baserat, fånga partiklar under en viss provtagning och använda filter för att utföra ytterligare tester. 17 personlig övervakning kräver ett litet system som kommer med nackdelen av färre prover.
Det finns många metoder att bestämma hälsoeffekter vid exponering för en aerosol. ALI modellen möjliggör aerosoler ska administreras direkt till cellerna genom luften som i en riktig exponeringsscenario, men det är mer kostnadseffektivt och mindre intensiv tid än in-vivo studier medan härma de luft-vätska hinder såsom ögon, hud och lungor. Lungceller som odlas på ALI har förmågan att generera en polariserad spärrskikt,18,19 som producerar fysiologiska egenskaper som liknar i vivo lung epitelet, inklusive slem och tensid produktion i specifika bronkial eller alveolära cellinjer, cilier slå,19 åtsittande föreningspunkter,19,20 och cell polarisering. 18 förändringar som dessa kan påverka cellulära svaret mätt i toxicitetsstudier. 21 dessutom ALI in vitro- modell resulterar är ofta mer känsliga än cellerna exponeras via fjädring modeller22 och kan modell akut i vivo inhalationstoxicitet. 23 , 24 därför en ALI exponering system som kan utföra mätningar inom andningszonen är ett naturligt nästa steg.
Genom att utsätta celler till aerosol direkt på källan till utsläpp, uppstår utredning av alla gaser, semi flyktiga ämnen och partiklar som är inblandade i blandningen effekter. När blandningen samlas på ett filter, gaser och flyktiga föreningar fångas inte och hela blandningen kan inte undersökas. Beredning av partiklar till ett pulver eller en flytande suspension kan dessutom leda till aggregering eller partikel-fluid interaktioner, till exempel upplösning, i flytande suspension. 25 , 26 när aerosolpartiklar läggs till vätskan, det finns en högre potential för tätbebyggelse,25,27 bildandet av ett protein corona,28 eller interaktion med föreningar i vätskan, vilket kan påverka nedfall och påverka biologiska svar. 29 , 30
Exponeringen vid ALI bygger på tre huvudsakliga aerosol profiler, cloud lösa, parallellt flöde och vinkelrät flöde. Moln avveckling, används av den luft-vätska gränssnitt Cell exponering (ALICE),4 är satsvis där partiklar insättning genom gravitationell och tröghetsseparation lösa som aerosoler behandlas som en enhet. Parallellt flöde, används av elektrostatiska Aerosol i vitro exponering System (TAKFOTEN)5 och Mångkulturåret exponering kammare (MEC) II,6 tillåter nedfall genom tillägg av Brownsk rörelse via flöde profilen. Vinkelrät flöde, används av en microsprayer,7 Nano Aerosol kammare för In Vitro-toxicitet (NACIVT),11 och kommersiella ALI system8,9,10,12, tillägger impaktion av partiklar inom regionen nedfall. Många av dessa exponering system är stor och skrymmande, som kräver överflödigt system för aerosol förkonditionering, pumpar för flöde, eller jämn uppvärmning kammare för inkubation av celler. Denna stora storlek minskar överförbarheten av systemet. I stället för provtagning direkt på källan till utsläpp har dessa system ofta prover inför de lab eller modell aerosoler som genereras för analys. Komplexiteten i de utsända Aerosolen kan vara förlorat i översättningen från fältet till labbet. PIVEC är mindre än nuvarande system, med en yttre yta på cirka 460 cm2 och väger endast 60 gram, med värme och luftfuktighet kontroll införlivas med de system som möjliggör en mycket portabel enhet. Minskad storlek och vikt att systemet ska bäras eller att källan till exponering, tillåter direkt provtagning.
Den stora storleken på nuvarande exponering system minskar även förmågan att utföra provtagning för att undersöka rumsliga övertoningar i koncentrationer. Denna resolution är nyckeln vid fastställandet av toxikologiska effekterna av många potentiella miljö- och yrkesrisker såsom vehicular avgaser partiklar materia eller arbetsplatsen aktiviteter där aerosolization uppstår. Omedelbart efter utsläpp, det blir en rumslig variansen i partikel koncentration. Detta växer med tiden när partiklarna skingra hela atmosfären och dessa effekter kan ändra beroende på omgivande förhållanden, såsom temperatur, tryck, vinden och solen. Partiklar kan börja åldras och oxidera samt en gång utsända31,32 och spridning priser påverkas av topografin; högre koncentrationer finns i canyons och tunnlar, där spridning effekter går långsammare och lägre koncentrationer kan hittas där det finns ett stort område för spridning. 33 dessa förändringar i dispersion priser kan ha betydande effekter på människors hälsa och kan ses när man jämför antalet astmatiska vuxna bor i urbana kontra i landsbygden inställningar. 34 medan många exponering system ger flera prover på en gång, flera system är det nödvändigt med ett överflöd av stora utrustning för att utföra rumsliga upplösningen.
Genom att labbet fältet, kan tidpunkten för analys minskas genom att använda hela cellen som en sensor. Följande kända biologiska mekanismer och slutpunkter kan stöd i fastställandet av aerosol sammansättning och storlek. På grund av långsamma clearance metoder, inklusive mukociliär clearance, fagocytos och flyttning, interagerar dessa partiklar ofta med celler för cirka dagar till veckor3 generera oxidativ stress, inflammation och även celldöd. Dessa biologiska endpoints kan vara utgångspunkterna för ogynnsamt utfall vägar för hjärt-kärlsjukdom eller kronisk obstruktiv lungsjukdom. Dessutom utförde Wiemenn et al. en array av in vitro- analyser att jämföra med litteratur värden för kort sikt i vivo inhalationstoxicitet. 35 In vivo svar förutspåddes med två av fyra positiva resultat från testning cytotoxicitet via laktatdehydrogenas release, oxidativ stress från glutation minskning och väteperoxid bildas och release, och inflammation potentiella från tumörnekrosfaktor alfa genen. Av tio nanosized metalloxider testade, testade sex som aktiv (titanoxid, zinkoxid och fyra olika cerium oxide) med exponering in vitro med bekräftelse i vivo.
För att studera effekterna av aerosoler i en yrkesmässig miljö, utvecklat vårt labb i PIVEC för exponeringar i fältet. Dessutom PIVEC kan bäras för personliga provtagning att övervaka och undersöka som den 37 mm filter kassetten36 exponering genom inandning eller flera system kan användas för att uppnå rumslig upplösning inom ett visst område. I detta protokoll diskuteras karakterisering och användningen av PIVEC. Efter exponering observeras de biologiska effekterna genom cytotoxicitet analyser.
Filterkassetter ger en enkel och billig metod för att samla in aerosoler i andningszonen; dock aerosol prover ur filter inte representerar hela aerosoler (dvs gaser, flyktiga ämnen och partiklar) och därmed begränsa bedömningen av relaterade biologiska effekter. Använder den ursprungliga utformningen av 37 mm filter kassetten, är PIVEC utformad för att underhålla bärbarhet och härma i vivo avsättning av partiklar från inandning. PIVEC är betydligt mindre än nuvarande ALI exponering system, ungefä…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Boris Solomonov och Virginia Commonwealth Innovation maskinverkstaden för hjälp med prototyper enheten. Författarna vill även tacka Cristian Romero-Fuentes i gruppen Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov och Virginia Commonwealth nanomaterial Core karakterisering anläggningen för deras hjälp med partikel karakterisering. Detta arbete stöds av start medel till Dr Lewinski från College of Engineering vid Virginia Commonwealth University.
Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
Resistive heater | |||
1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
Battery power bank | |||
Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |