Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Résumé

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34⁺ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Résumé

La transplantation de cellules (CSPH) souches et progénitrices hématopoïétique a été une thérapie de pierre angulaire pour la leucémie et autres cancers pendant près d’un demi-siècle, est le seul remède connu d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH-1) à la base et prometteuse immense dans le traitement des maladies génétiques comme la bêta-thalassémie. Notre groupe a élaboré un protocole de thérapie génique HSPC modèle de primates non-humains (PNH), permettant aux scientifiques d’optimiser les mêmes réactifs et techniques qui sont appliqués à la clinique. Nous décrivons ici les méthodes pour purifier le CD34⁺ HSPCs et des sous-ensembles de cellules souches hématopoïétiques (CSH) persistant à long terme d’apprêté la moelle osseuse (BM). Techniques identiques peuvent être utilisés pour la purification des autres sources HSPC (p. ex., mobilisé de sang périphérique des cellules souches [CSSP]). Décrit est un protocole de 2 jours dans lequel cellules sont purifiés, cultivées, modifiés avec lentivirus (LV) et préparés pour perfusion vers l’hôte autologue. Des lectures clés de succès comprennent la pureté de la CD34⁺ HSPC population, la capacité de HSPCs purifiés pour former des colonies morphologiquement distinctes dans les milieux semi-solides et, surtout, efficacité de modification génétique. Le principal avantage de la thérapie génique HSPC est la capacité à fournir une source de cellules longue durée de vie qui donnent lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques. Comme tel, ces méthodes ont été utilisées aux thérapies de modèle pour le cancer, les maladies génétiques et maladies infectieuses. Dans chaque cas, l’efficacité thérapeutique est établie en améliorant la fonction de la progéniture HSPC distincte, y compris les globules rouges, lymphocytes T, lymphocytes B ou sous-ensembles myéloïdes. Les méthodes pour isoler, modifier et préparer HSPC produits sont directement applicables et traduisible à plusieurs maladies chez des patients humains.

Introduction

Thérapie génique cellules souches est un moyen puissant pour traiter un large éventail de pathologies humaines. Thérapie génique HSPC est une approche particulièrement attractive, en raison de i) la facilité relative de recueillir ces cellules provenant de patients, ii) la richesse de la connaissance qui n’est disponible concernant les surface phénotypes cellulaires et ex vivo paramètres de culture et, comme le domaine s’agrandit, car iii) il présente des scientifiques avec une boîte à outils croissant de stratégies de modification génique adaptés à diverses maladies d’intérêt. Nous étudions activement HSPC gene therapy approches sous plusieurs angles, y compris les c....

Protocole

Autologue transplantations de PSN, d’amorçage (mobilisation), la collection de cellules et la modification des gènes sont menées conformes aux protocoles publiés précédemment²⁶. Toutes les procédures expérimentales sont examinées et approuvées par le Comité de l’utilisation de la Fred Hutchinson Cancer Research Center et l’Université de Washington et d’institutionnels animalier (protocole #3235 - 01). Toutes les études sont réalisées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health (« le Guide ») ; animaux ont été assignés au hasard à ces études.....

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus est conçu pour isoler et gène-modifier CD34 PSN⁺ HSPCs, qui peut ensuite être perfusé dans l’hôte autologue (Figure 1 et Figure 2). En suivant ce protocole, nous avons généralement obtenir jusqu'à 8 x 10⁹ totales globules blancs de BM apprêtée de macaques de queue de cochon et, parfois, double de ce montant de macaques rhésus. Chez les deux espèces, le nombre de CD34⁺.......

Discussion

Vecteur de LV ingénierie est la méthode la mieux caractérisée de gène-modifier les types de cellules comme CD34⁺ HSPCs, destinés à la transplantation ultérieure in vivo. Le protocole décrit ici est conçu pour maximiser le nombre de HSPCs modifiées qui persistent à long terme in vivo et fournir des avantages cliniques aux patients atteints de diverses maladies malignes, infectieuses et génétiques. Bien que les stratégies de modification génique ont vu le jour ces dix dernières années, les cellules modifiées LV .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Stemspam SFEM II (« HSPC ») MÉDIA	StemCell	09655
saline équilibrée de Hank’s	Gibco	14175095
solution saline tamponnée au phosphate	Gibco	14190-144
Pénicilline/streptomycine	Gibco	15140-122
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650-100
Laboratoires de décontamination	100 % éthanol	M18027161M
Cyclosporine	Sigma	30024-25MG
500 mM EDTA	Invitrogen	15575-038
Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur	Sigma Aldrich	PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2,5 mL, 1 µ ; g/µ ; L)	TaKaRA	T100B
Sérum Bovin Albumine	Sigma	A7906-100g
HEPES	Sigma	H9897
Rat anti-souris IgM billes magnétiques	Miltenyi Biotec	130-047-301
Facteur de cellules souches humaines recombinantes (SCF)	Peprotech	300-07
Thrombopoïétine humaine recombinante (TPO)	Peprotech	300-18
Tyrosine kinase 3 humaine recombinante de type FMS (FLT-3)	Peprotech	300-19
Sulfate de protamine	Sigma	P-4505
14 mL Polypropylène Tube à fond rond	Corning	352059
Colony Gel 1402	ReachBio	1402
Séparateurs QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS L25 Colonnes	Miltenyi biotec	130-042-401
10 mM PGE2	Cayman Chemical	14753-5mg
Fioles T-75 traitées TC	Bioexpress	T-3001-2
Fioles T-75 non traitées	Thermo-Fisher	13680-57
Seringues 20 mL	BD Biosciences	302830
Aiguilles 16,5 G	BD Capuchon
	BD Biosciences	305819
QuickExtract Solution d’ADN	Epicentre	QE09050
Capuchon de bandelette à 8 tubes Tubes PCR	USA scientific	1402-2708
Thermocycleur à 96 puits	Filtres de	4375786
	Miltenyi Biotec	130-041-407
Passoire, Cellule ; BD Faucon ; Stérile; Maille en nylon ; Taille des mailles : 70um ; Couleur : blanc ; 50/CS	fisher scientific	352350
Ultracomp ebeads	eBioscience	01-2222-42
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi	130-090-753
3 mL Seringues Luer-Lock	Thermo-Fisher	14823435
35 mm x 10 mm Boîte de culture cellulaire	Corning	430165
60 mm x 15 mm Boîte de culture cellulaire	Corning
Boîte de culture cellulaire de 150 mm x 25 mm	Corning	430599
Fioles non traitées TC	Falcon	353133
Qiagen Extraction d’ADN	Qiagen	51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone :5E10	Biolegend	328110
PE-CF594 Souris Anti-Human CD34 Clone :563	BD horizon	562449
Souris APC-H7 Anti-Human CD45RA Clone : 5H9	BD Pharmingen	561212
V450 Souris Anti-NHP CD45 Clone : d058-1283	BD Biosciences	561291
Sérum autologue	Prélevé sur l’hôte autologue et cryoconservé avant la mobilisation et la collecte des HSPC CD34+	N/A	Beard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches de repeuplement à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Milieu conditionné par le virus (VCM)	Laboratoire Kiem, FHCRC Centre coopératif d’excellence en hématologie (CCEH)	N/A	Beard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches de repeuplement à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Anticorps anti-CD34, clone 12.8	Kiem Lab	N/A	Beard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches repeuplées à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Introduction à Lenti F : AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA	Integrated DNA Technologies	N/A	Peterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par le SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Introduction Lenti R : TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA	Integrated DNA Technologies	N/A	Peterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Amorce d’actine F : TCCTGTGGCACTCACGAAACT	Integrated DNA Technologies	N/A	Peterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Amorce d’actine R : GAAGCATTTGCGGTGGACGAT	Integrated DNA Technologies	N/A	Peterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par le SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

Solution TC d’embout de seringue 305198 de précision pré-séparation Thermo-Fisher 430196