Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler
Summary
Målet med denne protokollen er å isolere nonhuman primas CD34+ celler fra primet benmargen, gen-endre disse cellene med lentiviral vektorer, og å forberede et produkt infusjon i autologous verten. Totalt er ca 48 timer.
Abstract
Blodkreft stilk og stamfar (HSPC)-cellen transplantasjon har vært en hjørnestein terapi for leukemi og andre kreftformer for nesten et halvt århundre, ligger under den eneste kjente kuren av humant immunsviktvirus (HIV-1), og viser enorme løftet i behandling av genetiske sykdommer som beta talassemi. Vår gruppe har utviklet en protokoll til modell HSPC genterapi i nonhuman primater (NHPs), slik at forskere til å optimalisere mange av de samme reagenser og teknikker som brukes i klinikken. Her beskriver vi metoder for rensing av CD34+ HSPCs og langsiktig vedvarende blodkreft stem cell (HSC) delsett fra primet benmargen (BM). Identiske teknikker kan anvendes for rensing av andre HSPC kilder (f.eks mobilisert perifert blod stamceller [PBSCs]). Beskrevet er en 2 dagers protokoll der celler er renset, kultivert, modifisert med lentivirus (LV) og forberedt for infusjon tilbake til autologous verten. Nøkkel readouts suksess inkluderer renheten av CD34+ HSPC befolkning, renset HSPCs evnen til å danne morphologically forskjellige koloniene i semisolid medier, og, viktigst, genet modifikasjon effektivitet. Den viktigste fordelen til HSPC genterapi er muligheten til å gi en kilde til langvarige celler som gir opphav til alle blodkreft celletyper. Som sådan, har disse metodene blitt brukt til modell behandling for kreft, genetiske sykdommer og infeksjonssykdommer. I hvert tilfelle, er terapeutiske effekten etablert av forbedrer funksjonen av forskjellige HSPC avkom, inkludert røde blodlegemer, T-celler, B celler eller myelogen delsett. Metodene for å isolere, endre og forberede HSPC produkter er direkte relevant og oversettbare til flere sykdommer i menneskelige pasienter.
Introduction
Stilk cellen genterapi er en kraftig måte å løse et bredt spekter av menneskelig patologi. HSPC gene terapi er en spesielt attraktivt tilnærming, på grunn av i) det er relative enkelt å samle disse cellene fra pasienter, ii) vell av kunnskap som er tilgjengelig om cellen overflaten fenotyper og ex vivo kultur parametere, og feltet utvides, fordi iii) det presenterer forskere med en stadig økende verktøykasse genet modifikasjon strategier tilpasset ulike sykdommer av interesse. Vi undersøker aktivt HSPC gene terapi tilnærminger fra flere vinkler, inkludert grunnleggende vitenskapen om HSPC biologi, engraftment av genet endret HSPCs i preklinisk i vivo modeller og programmet relevante pasientgrupper. Vi og andre har preget cellen overflaten fenotypen funksjonelt forskjellige HSPC delsett1,2,3, mobilisering og condition regimer som maksimerer HSPC avkastning og engraftment samtidig toksisitet4,5og genet modifikasjon og gen-redigering strategier som har blitt skreddersydd til en rekke ondartet, genetisk og infeksjonssykdommer6,7,8, 9,10. Funksjonen og engraftment av genet endret HSPCs kan evalueres på en rekke små og store-dyr modeller, inkludert mus, hunder og NHPs. NHP modeller er spesielt fordelaktig fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer spesifikke for HSPC celle overflaten proteiner som CD34 og CD90, kan brukes om hverandre i menneskelige og NHP celler. Videre, i motsetning til mus, store dyr som NHPs gir en nærmere tilnærming av omfanget av genet modifikasjon nødvendig for klinisk effekt. Endelig NHPs er gullstandarden for modellering av menneskelige sykdommer som HIV-1 smitte11 og er en voksende modellsystem for kandidaten anticancer og anti-HIV immunotherapies12,13.
Formålet med denne protokollen er å skissere metoder for rensing, genetisk modifisere og forberede NHP HSPC infusjon produktene. Selv utenfor rammen av denne protokollen, har vi tidligere vist at disse produktene engraft i autologous NHP verter, gi opphav til alle blodkreft linjene og gir terapeutisk effekt i et bredt spekter av sykdom modeller1. Vi har også preget av clonality av engrafting HSPCs og bygget en plattform for å spore kinetikk, smugling og fenotypen av personlige HSPCs og deres avkom, følgende autolog transplantasjon1,14. Metodene presenteres her er utviklet med følgende mål: i) for å isolere svært ren HSPCs og langsiktig engrafting HSC delsett, ii) å opprettholde primitive HSCs under ex vivo kultur og iii) å effektivt gen-endre enten bulk HSPCs eller lang sikt engrafting HSC delsett. Vi bruker magnetisk-assistert celle-sortering (Mac), samt fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), å isolere svært/funksjonelt forskjellige HSPC befolkninger, samsvar med metoder for mange grupper2,15, 16. Vedlikehold av primitive HSCs i kultur (dvs. minimere differensiering av disse cellene i forpliktet progenitors som gir opphav til fullt differensiert lymfoide og myeloide delsett) er en viktig fasett av protokollen beskrevet her. Selv om vi har tidligere preget tilnærminger for å utvide HSPCs samtidig beholde en primitiv fenotypen17,18, her beskriver vi en protokoll som fokuserer på å opprettholde HSCs via en minimal (48 h) og definert ex vivo kultur.
Effektiv endring av HSPCs og HSC delsett er et sentralt mål i denne protokollen. Blant flere tilnærminger vi har rapportert, to er langt den mest undersøkte i kliniske forsøk: LV-mediert genet modifikasjon og nuclease-mediert genet redigering1,6,19. Gene-redigering strategier bruker en av en rekke nuclease plattformer spesielt endre en målrettet genet av interesse, for eksempel C-C chemokine reseptor inn 5 (CCR5) for behandling av HIV infeksjon7,19 eller Bcl11A for behandling hemoglobinopathies6. Her fokusere vi på LV-mediert genet modifikasjon, der transgene Last integrere semirandomly i genomet1,8,20. En viktig fordel med LV tilnærminger er muligheten til å levere store mengder av genetisk materiale (opp til 8 eller 9 kilobases). Selv om gen-redigering strategier utvikles for å målrette en transgene rundt å integrere bare på et bestemt locus av homologe donor rekombinasjon (HDR), krever disse metodene ytterligere utvikling in vitro og små dyr modeller. I kontrast, har LV vektorer blitt brukt mye i NHPs og pasienter21,22. Viktigere, kan protokollen beskrevet her, som bruker primet BM som starter HSPC kilde, enkelt og bredt tilpasses, for eksempel for å isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, tar vi nytte av høye grad av genetisk likhet mellom NHPs og mennesker bruke reagensene som gjelder for begge arter. Til slutt har denne tilnærmingen blitt tilpasset for å endre andre blodkreft undergrupper, nemlig T celler12,23,24; ankomsten av effektiv T-celle immunterapi tilnærminger har støttet seg tungt på LV plattformen benyttet i denne protokollen. Disse metodene er passende for noen forsker interesse HSPC biologi eller LV-mediert genet modifikasjon. For eksempel HSPC rensing protokollen presenteres her kan brukes til å karakterisere romanen HSC-beriket undergrupper, som beskrevet tidligere1,15,25. Likeledes, LV signaltransduksjon metoder presenteres her kunne likeledes anvendt og videreutviklet for mange andre celletyper og eksperimentelle spørsmål, både i vitro og in vivo modeller.
I sammendraget presenterer vi metoder for å isolere og genetisk endre NHP HSPCs. Disse metodene kan lett tilpasses for andre arter og andre HSPCs. Denne nøye utvalgte protokollen viser store løftet i modellering av effektiv terapi for mange menneskelige sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
LV vektor engineering er best preget metoden gen-endre celletyper som CD34+ HSPCs, for etterfølgende transplantasjon i vivo. Protokollen beskrevet her er utformet for å maksimere antall genet modifisert HSPCs som vedvarer langsiktig i vivo, og gi kliniske fordeler til pasienter med ulike ondartet smittsomme og genetiske sykdommer. Selv om gen-redigering strategier har dukket opp det siste tiåret, LV-endret celler er best studerte i vitro, dyremodeller og pasienter,1,,<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Helen Crawford for å forberede dette manuskriptet, Jim Woolace for grafisk design, og Veronica Nelson og Devikha Chandrasekaran for å delta i utviklingen av protokollen. Utviklingen av denne protokollen ble støttet av tilskudd fra NIH National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (R01 AI135953 og AI138329 til H.P.K.) og National hjerte, lunge og blod Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 og U19 HL129902 til H.P.K.), samt NIH P51 OD010425, og delvis gjennom NIH/NCI Cancer Center, støtte Grant P30 CA015704. H.P.K. er en Markey molekylær medisin etterforsker og mottatt støtte som den første mottakeren av José Carreras/E. Donnall Thomas utstyrt stolen for kreftforskning og Fred Hutch utstyrt stolen for celle- og Gene Therapy.
Materials
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 ml syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
References
- Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), (2017).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
- Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
- Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
- Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
- Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
- Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
- Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
- Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
- Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
- Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
- Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
- Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
- Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
- Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
- Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
- Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
- Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
- Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
- Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
- Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
- Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
- Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
- Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
- Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
- Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
- Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
- Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
- Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
- Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).
