Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la formation d’une population de cellules à l’aide de stimuli électriques et mécaniques, émulant la physiologie cardiaque. Cette stimulation électromécanique améliore le potentiel de cardiomyogénique des cellules traitées et est une stratégie prometteuse pour autre thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.

Abstract

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans les pays développés. Par conséquent, la demande pour des thérapies efficaces cellule cardiaque a motivé des chercheurs dans les domaines de la bio-ingénierie et de cellules souches pour développer en vitro haute-fidélité humaine myocarde pour la recherche fondamentale et les applications cliniques. Cependant, le phénotype immature des cellules cardiaques est une limitation sur l’obtention de tissus qui imitent fonctionnellement le myocarde adult, qui se caractérise principalement par des signaux mécaniques et électriques. Ainsi, le but du présent protocole est de préparer et de maturité de la population de cellules cibles par le biais de la stimulation électromécanique, récapitulant les paramètres physiologiques. Génie tissulaire cardiaque évolue vers des approches plus biologiques, et des stratégies fondées sur des stimuli biophysiques, ainsi, sont accélèrent. Le dispositif mis au point à cet effet est unique et permet individuelle ou simultanée électrique et mécanique stimulation, soigneusement caractérisés et validées. En outre, bien que la méthodologie a été optimisée pour ce stimulateur et une population de cellules spécifiques, il peut être facilement adaptée à d’autres dispositifs et les lignées cellulaires. Les résultats présentés ici offrent la preuve de l’engagement cardiaque accrue de la population cellulaire après stimulation électromécanique. Cellules stimulées électro-mécaniquement montrent une augmentation de l’expression des principaux marqueurs cardiaques, y compris des gènes précoces, structurales et régulatrices du calcium. Ce conditionnement cellulaire pourrait être utile pour encore la thérapie régénératrice cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues de haut débit.

Introduction

La fonction cardiaque est basée sur le couplage de l’excitation électrique et mécanique contraction. Brièvement, jonctions intercellulaires cardiomyocyte permettent de propagation du signal électrique pour produire des contractions presque synchrones du coeur qui pompe le sang systémique et à travers le système pulmonaire. Les cellules cardiaques, subissent ainsi, électriques et mécaniques des forces qui régissent la fonction cellulaire et de l’expression du gène. En conséquence, plusieurs groupes ont tenté de développer des plates-formes de culture qui imitent l’environnement physiologique cardiaque pour comprendre le rôle de stimulation mécanique et électrique sur l....

Protocol

Cette étude utilise une ATDPCs cardiaque humaine d’échantillons de patients. Leur utilisation a été approuvée par le Comité d’éthique local et tous les patients ont donné un consentement éclairé. Le protocole de l’étude est conforme aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki.

1. les préparatifs

1. Autoclave deux pincettes, 12 électrodes de platine PTFE pour la stimulation électrique et quelques serviettes en papier, à 121 ° C pendant 20 min.
2. Stériliser des constructions sur mesure de PDMS 12 (Figure 1A).
   1. Lavez chaque construction avec 5 mL d’eau distillée s....

Results

La figure 2 représente le schéma général suivi pour la stimulation des cellules. Brièvement, les cellules ont été ensemencées sur la construction PDMS et soumis à une stimulation électromécanique, avec un changement de support effectué deux fois par semaine. Les cellules stimulées ont été utilisés comme un contrôle pour la climatisation electromecanique. En outre, nous avons ajouté un contrôle supplémentaire à l’expérience, et ATDPCs sous-cutanée ont servi un.......

Discussion

La stimulation électromécanique semble être une alternative sûre pour préparer des cellules pour un environnement hostile cardiaque et renforcer leur engagement cardiaque. Ici, un protocole décrit pour cellules souches cardiaques a augmenté l’expression de marqueurs cardiaques principales et a été rapporté pour être bénéfique pour leur prochaine implantation le myocarde murin infarci³⁰. En général, électromécanique stimulées ATDPCs cardiaques a augmenté l’expression de gènes liés à tôt, structurel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
fort
Aimants en néodyme nickelé	Supermagnete	Q-10-10-05-N
Aimants en néodyme nickelé	Supermagnete	Q-06-04-02-HN
polydiméthylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning Corp	184
réseau de diffraction réglé (1250 rainures/mm)	Newport	05RG150-1250-2
Contrôleur de moteur	Faulhaber	MCLM-3006-S
Labview	National Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70013-065
0.05 % trypsine-EDTA	Gibco	25300-120
Boîte de culture cellulaire 35 mm	BD Falcon	45353001
sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100x	Gibco	25030-024
Pénicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL	Gibco	15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)	Sigma	M4526-24x500ML
Protéines & Analyses d’ARN forte
protéase	Sigma	P8340
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306
AllPrep Kit ARN/Protéines	Qiagen	50980404
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
iTaq Sondes universelles Kit en une étape	Bio-Rad Laboratories	172-5140
Hexamères aléatoires	Qiagen	79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2x	Applied Biosystems	4391128
TaqMan Universal PCR MasterMix	Applied Biosystems	4324018
Immunostaining
10 % formalin	Sigma	HT-501128-4L
sérum pour chevaux	Sigma	H1138
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
Sérum bovin albumine (BSA)	Sigma	A7906-100G
PARAFILM	Sigma	P6543
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sigma	D9542
Phalloidin Alexa 568	Invitrogen	A12380
azoture de sodium	Sigma	S8032-100g
Hoechst 33342	Sigma	14533
Connexin-43 anticorps primaire de lapin	Sigma	C6219 lot#061M4823
sarcomérique &alpha ;-actinine souris anticorps primaire	Sigma	A7811 lot#080M4864
GATA-4 chèvre anticorps primaire	R& D	AF2606 VAZ0515101
MEF2 anticorps primaire de lapin	Santa Cruz	sc-313 lot#E0611
SERCA2 anticorps primaire de chèvre	Santa Cruz	sc-8095 lot#D2709
Cy3 anticorps secondaire	Jackson ImmunoResearch	711-165-152
Cy3 anticorps secondaire	Jackson ImmunoResearch	715-165-151
Cy3 secondaire anticorps	Jackson ImmunoResearch	712-165-150
Anticorps secondaire Cy2	Jackson ImmunoResearch	715-225-150
Anticorps secondaire Cy2	Jackson ImmunoResearch	711-225-152
Anticorps secondaire Cy2	Jackson ImmunoResearch	705-225-147