Kvantificere den heterogen fordeling af en Synaptic Protein i mus hjernen bruger immunfluorescens
Summary
Her, beskriver vi en kvantitativ tilgang til fastlæggelse af fordelingen af en synaptic protein i forhold til en markør protein ved hjælp af immunofluorescens farvning, Konfokal mikroskopi og computer-baseret analyse.
Abstract
Tilstedeværelse, fravær eller niveauer af specifikke synaptic proteiner kan alvorligt påvirke synaptisk transmission. Ud over belyse funktion af et protein, er det vigtigt at også bestemme dens udbredelse. Her, beskriver vi en protokol ansættelse immunofluorescens, Konfokal mikroskopi og computer-baseret analyse til at fastlægge fordelingen af synaptic protein Mover (også kaldet TPRGL eller SVAP30). Vi sammenligner distribution af Mover til af synaptic vesikel protein synaptophysin, derved bestemme fordelingen af Mover i en kvantitativ måde i forhold til overfloden af synaptiske vesikler. Især kunne denne metode potentielt blive gennemført for at give mulighed for sammenligning af fordelingen af proteiner ved hjælp af forskellige antistoffer eller mikroskoper eller på tværs af forskellige undersøgelser. Vores metode omgår de iboende variation af immunfluorescent stainings ved fremstilling af et forhold i stedet for absolutte fluorescens niveauer. Derudover metoden vi beskrive gør det muligt for forskeren at analysere fordelingen af et protein på forskellige niveauer: fra hele hjernen skiver til hjerneregioner til forskellige underregioner i en hjerne område, som de forskellige lag af hippocampus eller sensoriske cortex. Mover er en hvirveldyr-specifikke proteiner, der er knyttet til synaptiske vesikler. Med denne metode viser vi, at Mover er uensartet fordelt på tværs af områder i hjernen, med høje niveauer i den ventrale pallidum, septal atomkerner og amygdala, og også inden for enkelt hjernen områder, som de forskellige lag af hippocampus.
Introduction
Kommunikationen mellem neuroner sker på specialiserede kontakt websteder kaldes synapser. Synapser indeholder et utal af forskellige proteiner, der dirigerer synaptisk transmission. Nogle af disse proteiner Vis en heterogen fordeling i hele nervesystemet og er ikke til stede i hver synapse1. Et eksempel på sådan et protein er Munc13, der er involveret i priming processen med synaptiske vesikler. Der er forskellige isoformer af Munc13, som er uensartet fordelt i hele hjernen2, og tilstedeværelse eller fravær af specifikke isoformer kan påvirke kortsigtede synaptisk plasticitet og synaptic vesikel dynamics3, 4 , 5. det er derfor af afgørende betydning at kunne identificere tilstedeværelsen af forskellige synaptic proteiner på tværs af områder i hjernen.
Metoderne til valg af kvantificering af synaptic proteiner – indtil videre – er massespektrometri og Western blotting, snarere end Immunhistokemi6,7,8,9. I nogle tilfælde er flere metoder brugt til at supplere hinanden for at vurdere både antallet og lokaliseringen af specifikke proteiner (dvs., Wilhelm et al. 10). den metode, vi beskriver her giver mulighed for lokalisering og kvantificering af proteiner af interesse uden at bruge nogen biokemiske metode, blot beskæftiger immunfluorescent stainings. En anden fordel her er at kvantificeringen kan ske over områder meget mindre, og derfor mere konkret, end dem, der gennemføres af andre metoder. Dog skal man tage i betragtning at en pålidelig reference protein er nødvendig for at vurdere fordelingen af protein af interesse.
Fluorescerende farvning af Immunhistokemi tillader os at rutinemæssigt identificere lokalisering af proteiner i hele hjernen områder samt inden for forskellige neuronal rum. For at identificere de forskellige rum, anvendes specifik markører. Typisk, antistoffer mod synapsin og synaptophysin11 kan bruges til at mærke synaptiske vesikler, mens antistoffer mod Fagot mærke den aktive zone af en præsynaptiske terminal12. Vesikulær transportvirksomheder, såsom vesikulære glutamat transportører (vGluT) eller vesikulær GABA transporter (vGAT), der bruges til at mærke excitatoriske13 og hæmmende14 præsynaptiske terminaler, henholdsvis. På den postsynaptiske side, kan antistoffer mod Homer protein være ansat til at markere postsynaptiske terminaler og antistoffer mod postsynaptiske tæthed protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan mærke excitatoriske eller hæmmende postsynaptiske terminaler, henholdsvis. Ved hjælp af antistoffer mod et protein af interesse og markører som dem, der er beskrevet ovenfor, kan man bestemme lokalisering af sådant protein. Mange undersøgelser til dato har gjort dette i en kvalitativ måde21. Dog Bestem pålideligt differential fordelingen af en bestemt synaptic protein, skal man ikke kun bestemme dets tilstedeværelse eller fravær men også dets relative koncentration. Heterogenitet af størrelser og tæthed af synapser gør det vigtigt at etablere et forhold mellem den synaptiske markør og protein af interesse. Ellers vil synapse-rige regioner som de ikke-pyramideformede lag af hippocampus og den molekylære lag af lillehjernen vise en høj tæthed af synaptic proteiner, kun på grund af den højere tæthed af synapser, men ikke på grund af en stærk tilstedeværelse af dette protein i hver synapse (fx, Wallrafen og Dresbach1). På den anden side vil proteiner i de neuronale soma (fx, TGN3822) normalt vise stærke tilstedeværelse i hippocampus pyramideformet cellelag eller hippocampus eller cerebellare granulet cellelag på grund af den høje koncentration af neuronal celle organer i disse områder. Derfor, denne ikke-homogen fordeling af strukturer, i dette tilfælde synapser, kan føre til en falsk estimering af fordeling af protein af interesse, selv. Desuden er der en iboende variabilitet i farvning intensiteter over prøver i immunhistokemisk stainings. Protokollen beskrevet her tager dette i betragtning og undgår sådanne afvigelser, samt andre forbehold, der opstår fra immunhistokemiske metoder.
I vores seneste undersøgelse, vi har brugt denne metode til at beskrive det differentierede udtryk af Mover (også kaldet TPRGL23 eller SVAP3024) på tværs af 16 forskellige hjernen områder1. Mover er en hvirveldyr-specifikke synaptic protein, der findes i tilknytning til synaptiske vesikler og påvirker neurotransmitter frigivelse25,26,27. Vi har relateret Mover udtryk til overflod af synaptiske vesikler, ved farvning for synaptophysin som synaptic vesikel reference markør. Vi fandt høje niveauer af Mover navnlig de septal kerner, de ventrale pallidum og amygdala. I hippocampus fandt vi en heterogen fordeling af Mover, med høje niveauer i lag forbundet med intra-hippocampus beregning, og lave niveauer i input- og output lag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden, der præsenteres her sigter mod at kvantificere distribution af et protein af interesse i forhold til overfloden af en markør protein med en kendt distribution. Immunfluorescens farvning kan vise en høj variation af farvning intensitet mellem forskellige skiver. Kvantificering fremgangsmåden her omgår dette problem ved at bestemme forholdet mellem protein af interesse for gennemsnitlige tværs over halvkugle. Derfor forskellige farvning intensiteter over skiver er aflyst og giver mulighed for en kvantitativ …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Irmgard Weiss for fremragende teknisk bistand. Forfatterne anerkende støtte af Hermes Pofantis og Andoniya Petkova. Forfatterne også takke den europæiske Neuroscience Institute for brugen af LSM800 og teknisk bistand, især af Dr. Nils Halbsgut. Dette arbejde blev finansieret af University Medical Center Göttingen. JSV anerkender støtte af Center for nanoskala mikroskopi og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
