Kvantifiera heterogen fördelning av ett Synaptic Protein i mus hjärnan med hjälp av immunofluorescens
Summary
Här beskriver vi en kvantitativ metod att bestämma fördelningen av ett synaptic protein i förhållande till en markör protein med hjälp av immunofluorescens färgning, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys.
Abstract
Den närvaro, frånvaro eller nivåer av specifika synaptic proteiner kan allvarligt påverka synaptisk transmission. Förutom att belysa funktionen av ett protein, är det viktigt att även kartlägga dess utbredning. Här beskriver vi ett protokoll som sysselsätter immunofluorescens, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys för att bestämma fördelningen av proteinet synaptiskt Mover (även kallad TPRGL eller SVAP30). Vi jämför fördelningen av Mover som den synaptiska vesikelproteinet protein synaptophysin, därmed att bestämma fördelningen av Mover på ett kvantitativt sätt i förhållande till överflödet av synaptiska vesikler. Särskilt, skulle denna metod potentiellt kunna genomföras för att möjliggöra jämförelse av fördelningen av proteiner med olika antikroppar eller Mikroskop eller mellan olika studier. Vår metod kringgår det inneboende variabilitet av Immunofluorescerande infärgning av ger förhållandet snarare än absoluta fluorescens nivåer. Dessutom, den metod som vi beskriver gör det möjligt för forskaren att analysera fördelningen av ett protein på olika nivåer: från hela hjärnan skivor till hjärnan till olika delområden i en hjärna området, såsom de olika lagren av hippocampus eller sensoriska cortices. Mover är ett ryggradsdjur-specifika protein som associeras med synaptic blåsor. Med den här metoden visar vi att Mover fördelas ojämnt över hjärnområden, med höga nivåer i den ventrala pallidum, septal atomkärnor och amygdala, och även inom enda hjärnan, såsom hippocampus olika lager.
Introduction
Kommunikationen mellan nervceller händer på specialiserade kontakt webbplatser kallas synapser. Synapser innehåller en myriad av olika proteiner som orkestrera synaptisk transmission. Några av dessa proteiner visar en heterogen fördelning i hela nervsystemet och är inte närvarande i varje synaps1. Ett exempel för ett sådant protein är Munc13, som är involverat i processen priming av synaptiska vesikler. Det finns olika isoformer av Munc13, som är heterogent fördelat i hela hjärnan2, och närvaron eller frånvaron av särskilda isoformer kan påverka kortsiktiga synaptisk plasticitet och synaptiskt vesikelprotein dynamics3, 4 , 5. det är därför av avgörande betydelse för att kunna identifiera förekomsten av olika synaptic proteiner över hjärnområden.
Metoderna av val för kvantifiering av synaptic proteiner – hittills – är masspektrometri och Western blotting, i stället för immunohistokemi6,7,8,9. I vissa fall metoderna flera kompletterar varandra för att bedöma både kvantiteten och lokalisering av specifika proteiner (dvs, det Wilhelm o.a. 10). den metod som vi beskriver här tillåter för lokalisering och kvantifiering av proteiner av intresse utan att behöva använda någon biokemisk metod, helt enkelt anställa Immunofluorescerande infärgning. En annan fördel här är att kvantifiering kan göras över områden mycket mindre och därför mer specifika, än de som uppnås med andra metoder. Dock måste man beakta att en tillförlitlig referens protein behövs för att bedöma fördelningen av proteinet av intresse.
Fluorescerande färgning av immunohistokemi tillåter oss att rutinmässigt identifiera lokaliseringen av proteiner i hjärnområden samt inom olika neuronala fack. För att identifiera de olika fack, används specifika markörer. Antikroppar mot synapsin och synaptophysin11 kan vanligtvis användas att märka synaptic vesicles, medan antikroppar mot fagott etikett den aktiva zonen av en presynaptiska terminal12. Vesikulär transportörer, såsom vesikulär glutamat transportörer (vGluT) eller vesikulär GABA transportör (vGAT), används för att märka excitatoriska13 och hämmande14 presynaptiska terminaler, respektive. På postsynaptiska sida, kan antikroppar mot Homer proteinet användas för att markera postsynaptiska terminaler och antikroppar mot postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan märka retande eller hämmande postsynaptiska terminaler, respektive. Med hjälp av antikroppar mot ett protein av intresse och markörer såsom de som beskrivs ovan, kan man bestämma localizationen av sådant protein. Många studier hittills har gjort i en kvalitativ sätt21. Dock för att tillförlitligt avgöra differentiell fördelningen av ett specifikt synaptic protein, måste man inte bara bestämma dess närvaro eller frånvaro men också dess relativa koncentration. Heterogenitet i storlekar och täthet av synapser gör det viktigt att fastställa en kvot mellan den synaptiska markören och proteinet av intresse. Annars, synaps-rika regioner såsom icke-pyramidal lager av hippocampus och det molekylära lagret av lillhjärnan visar en hög täthet av synaptic proteiner, endast på grund av den högre tätheten av synapser men inte på grund av en stark närvaro av det proteinet i varje synaps (t.ex., Wallrafen och Dresbach1). Å andra Visa proteiner i de neuronala soma (t.ex., TGN3822) vanligtvis stark närvaro i hippocampus pyramidal cellager eller Hippocampus eller cerebellär granule cellager på grund av den höga koncentrationen av neuronala cellen organ i dessa områden. Därför denna icke-homogen fördelning av strukturer, i detta fall synapser, kan leda till en falsk uppskattning av fördelningen av proteinet av intresse själv. Dessutom finns det en inneboende variabilitet i färgning stödnivåer över prover i immunhistokemiska färgningar. Protokollet beskrivs här tar hänsyn till detta och undviker sådana fördomar, liksom andra varningar som uppstår från immunohistokemiska metoder.
I vår senaste studie, vi har använt denna metod för att beskriva differentiell uttrycket av Mover (även kallad TPRGL23 eller SVAP3024) över 16 olika hjärnan områden1. Mover är ett ryggradsdjur-specifika synaptic protein som finns i föreningen till synaptic blåsor och påverkar signalsubstansen pressmeddelande25,26,27. Vi har släkt Mover uttrycket att överflödet av synaptiska vesikler, genom färgning för synaptophysin som synaptiskt vesikelprotein referens markör. Vi hittade höga halter av Mover särskilt i septal atomkärnor, den ventrala pallidum och amygdala. Inom hippocampus hittade vi en heterogen fördelning av Mover, med höga nivåer i samband med intra-Hippocampus uträkningen, och låga nivåer i in- och utdata lager lager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden presenteras här syftar till att kvantifiera distribution av ett protein av intresse i förhållande till överflödet av ett protein som markör med en känd fördelning. Immunofluorescens färgning kan visa en hög variabilitet av färgning stödnivåer mellan olika skivor. Metoden kvantifiering beskrivs här kringgår detta problem genom att bestämma förhållandet mellan proteinet av intresse för genomsnittet över halvklotet. Därför olika färgning intensiteter över segment ställs och möjliggöra en k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Irmgard Weiss för utmärkt tekniskt bistånd. Författarna erkänner stöd av Hermes Pofantis och Andoniya Petkova. Författarna vill även tacka Europeiska neurovetenskap Institutet för användning av LSM800 och tekniskt bistånd, särskilt genom Dr Nils Halbsgut. Detta arbete finansierades av vid University Medical Center Göttingen. JSV erkänner stöd av Center för nanoskala mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
