Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência
Summary
Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.
Abstract
A presença, ausência ou níveis de proteínas específicas sinápticas severamente podem influenciar a transmissão sináptica. Além de elucidar a função de uma proteína, é vital para determinar também sua distribuição. Aqui, descrevemos um protocolo empregando imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseados em computador para determinar a distribuição da proteína sináptica Mover (também chamado TPRGL ou SVAP30). Comparamos a distribuição de motor para que a vesícula sináptica proteína Sinaptofisina, desse modo, determinar a distribuição de Mover de forma quantitativa em relação a abundância das vesículas sinápticas. Notavelmente, esse método poderia potencialmente ser implementado para permitir a comparação da distribuição de proteínas usando anticorpos diferentes ou microscópios ou em diferentes estudos. Nosso método contorna a variabilidade inerente de imunofluorescência citológicas por rendendo uma relação, ao invés de níveis absolutos de fluorescência. Além disso, descrevemos o método permite que o pesquisador analisar a distribuição de uma proteína em diferentes níveis: de fatias de cérebro inteiro para regiões do cérebro para diferentes sub-regiões na área do cérebro, como as diferentes camadas do hipocampo ou sensorial córtices. Motor é uma proteína de vertebrado específico que está associada com vesículas sinápticas. Com esse método, nós mostramos que o motor é heterogénea em todas as áreas do cérebro, com níveis elevados no pallidum ventral, os núcleos septais e a amígdala e também dentro de áreas do cérebro único, tais como as diferentes camadas do hipocampo.
Introduction
Comunicação entre os neurônios acontece em sites especializados de contato chamados sinapses. Sinapses contêm uma miríade de diferentes proteínas que orquestrar a transmissão sináptica. Algumas dessas proteínas mostram uma distribuição heterogênea em todo o sistema nervoso e não estão presentes em cada sinapse1. Um exemplo de tal uma proteína é Munc13, que está envolvida no processo de preparação das vesículas sinápticas. Existem diferentes isoformas de Munc13, que são distribuídas de forma heterogénea ao longo do cérebro2, e a presença ou ausência de isoformas específicas pode influenciar a curto prazo plasticidade sináptica e vesícula sináptica dinâmica3, 4 , 5. portanto, é de vital importância para ser capaz de identificar a presença de diferentes proteínas sinápticas em todas as áreas do cérebro.
Os métodos de escolha para quantificação de proteínas sinápticas – até agora – são espectrometria de massa e mancha ocidental, ao invés de immunohistochemistry6,7,8,9. Em alguns casos, vários métodos são usados para se complementam para avaliar tanto a quantidade e a localização de proteínas específicas (ou seja, Wilhelm et al . 10). o método descrevemos aqui permite a localização e quantificação de proteínas de interesse sem a necessidade de usar qualquer método bioquímico, simplesmente empregando colorações de imunofluorescência. Outra vantagem aqui é que a quantificação pode ser feita sobre áreas muito menores e, portanto, mais específicos, do que aqueles obtidos por outros métodos. No entanto, é preciso levar em consideração que uma proteína de referência confiável é necessária para avaliar a distribuição da proteína de interesse.
Coloração fluorescente por imuno-histoquímica permite identificar rotineiramente a localização de proteínas em todas as áreas do cérebro, bem como no âmbito de diferentes compartimentos neuronais. Para identificar os diferentes compartimentos, marcadores específicos são utilizados. Normalmente, os anticorpos contra synapsin e Sinaptofisina11 podem ser usados para rotular vesículas sinápticas, enquanto anticorpos contra Fagote rotular a zona ativa de um terminal pré-sináptica12. Os transportadores vesiculares, tais como os transportadores de glutamato vesicular (vGluT) ou transportador vesicular de GABA (vGAT), são usados para rotular excitatórios13 e inibitórios14 terminais pré-sináptica, respectivamente. No lado pós-sináptica, anticorpos contra a proteína de Homer podem ser empregados para marcar terminais pós-sinápticos e anticorpos contra a densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95)15,16,17 ou gephyrin18 , 19 , 20 pode rotular terminais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios, respectivamente. Usando anticorpos contra uma proteína de interesse e marcadores tais como as descritas acima, pode-se determinar a localização de tais proteínas. Muitos estudos até à data este feito em uma maneira qualitativa21. No entanto, para determinar a distribuição diferencial de uma proteína sináptica específica de forma fiável, um deve não somente determinar sua presença ou ausência, mas também sua concentração relativa. A heterogeneidade de tamanhos e densidade de sinapses tornam importante estabelecer uma relação entre o marcador sináptico e a proteína de interesse. Caso contrário, regiões de sinapse-ricos tais como as camadas não-piramidais do hipocampo e a camada molecular do cerebelo mostrará uma alta densidade de proteínas sinápticas, apenas devido à maior densidade de sinapses, mas não devido a uma forte presença de proteínas na cada sinapse (por exemplo, Wallrafen e Dresbach1). Por outro lado, as proteínas no soma neuronal (por exemplo, TGN3822) mostrará geralmente forte presença na célula piramidal hippocampal camada ou camada de célula grânulo hippocampal ou cerebelar devido a alta concentração de corpos de células nessas áreas. Portanto, esta distribuição não homogênea de estruturas, neste caso as sinapses, pode levar a uma falsa estimativa da distribuição da proteína de interesse em si. Além disso, há uma variabilidade intrínseca as intensidades de coloração através de amostras em colorações imuno-histoquímica. O protocolo descrito aqui leva isso em consideração e evita tais preconceitos, bem como outras limitações que surgem a partir de métodos de imuno-histoquímica.
Em nosso recente estudo, nós usamos este método para descrever a expressão diferencial de motor (também chamado de TPRGL23 ou SVAP3024) através de de áreas cerebrais diferentes 161. Motor é uma proteína sináptica vertebrado-específicos que pode ser encontrada em associação com vesículas sinápticas e influencia a liberação de neurotransmissor25,26,27. Podemos ter relacionado a expressão de Mover para a abundância das vesículas sinápticas, manchando para Sinaptofisina como um marcador de referência de vesícula sináptica. Encontramos altos níveis de motor particularmente em núcleos septais, o pallidum ventral e a amígdala. Dentro do hipocampo, encontramos uma distribuição heterogênea de motor, com altos níveis nas camadas associadas a computação intra-hipocampo e níveis baixos em camadas de entrada e saída.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado tem como objetivo quantificar a distribuição de uma proteína de interesse em relação à abundância de uma proteína do marcador, com uma distribuição conhecida. Mancha da imunofluorescência pode mostrar uma grande variabilidade de coloração intensidades entre diferentes fatias. A abordagem de quantificação descrita aqui contorna este problema, determinando a proporção da proteína de interesse para a média em todo o hemisfério. Portanto, diferentes intensidades de coloração e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Irmgard Weiss excelente assistência técnica. Os autores reconhecem apoio por Hermes Pofantis e Andoniya Petkova. Os autores também agradecer o Instituto Europeu de neurociência para o uso do LSM800 e assistência técnica, especialmente pelo Dr. Nils Halbsgut. Este trabalho foi financiado pela Göttingen centro médico da Universidade. JSV reconhece apoio pelo centro de microscopia de escala nanométrica e fisiologia Molecular do cérebro (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
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