Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının
Summary
Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Ciddi varlığı, yokluğu veya belirli sinaptik proteinlerin seviyeleri sinaptik iletimi etkisi altına alabiliyor. Işlev bir protein elucidating ek olarak, ayrıca dağılımı belirlemek için önemlidir. Burada, biz istihdam ayirt, confocal mikroskobu ve sinaptik protein (TPRGL veya SVAP30 olarak da adlandırılır) taşıyıcı dağılımını belirlemek için analiz bilgisayar tabanlı bir protokol tanımlamak. Biz taşıyıcı dağıtım sinaptik vezikül protein synaptophysin olan için böylece sinaptik veziküller bolluk göre nicel bir şekilde hareket ettirmek dağıtımını belirleme karşılaştırın. Özellikle, bu yöntem dağıtım farklı antikorlar veya mikroskoplar kullanarak proteinlerin veya farklı çalışmalar arasında karşılaştırılması için izin vermek için potansiyel olarak uygulanabilir. Bizim Yöntem immünfloresan stainings doğasında değişkenliği mutlak floresans düzeyleri yerine bir oranı verimli kaçınmanızı sağlar. Ek olarak, farklı düzeylerde bir proteinin dağıtım analiz etmek araştırmacı tarif yöntemi sağlar: beyin bölgeleri için farklı katmanları oluşur veya duyusal gibi bir beyin alanına farklı milletlere dilimlere tüm beyin üzerinden cortices. Taşıyıcı sinaptik veziküller ile ilişkili bir omurgalılar özgü proteindir. Bu yöntemle, gösterdiğimiz taşıyıcı heterogeneously yüksek seviyelerde ventral yarayan, septal çekirdekleri ve amigdala ve hipokampus farklı katmanları gibi tek beyin bölgeleri içinde beyin bölgeleri arasında dağıtılır.
Introduction
Sinir hücreleri arasındaki iletişimi sinapslarda denilen özel kişi sitelerinde olur. Sinapsların sayısız sinaptik iletimi yönetmek farklı protein içerir. Bazı bu proteinlerin sinir sistemi boyunca heterojen bir dağılımını göstermek ve her synapse1‘ mevcut değildir. Bir tür bir protein için sinaptik veziküller astar sürece dahil Munc13 örnektir. Heterogeneously beyin2dağıtılır, Munc13, ve farklı izoformlarının vardır ve belirli izoformlarının olup kısa vadeli sinaptik plastisite ve sinaptik vezikül dynamics3, üzerinde etkili olabileceği 4 , 5. bu nedenle, beyin bölgeleri arasında farklı sinaptik proteinlerin varlığı tespit edebilmek için hayati önem taşıyor.
Seçim yöntemleri için miktar sinaptik proteinler – defa – kütle spektrometresi ve Western blot yerine, immünhistokimya6,7,8,9vardır. Bazı durumlarda, miktar ve spesifik proteinlerin (yani, Wilhelm ve ark. lokalizasyonu değerlendirmek için birbirlerini tamamlayıcı için çeşitli yöntemler kullanılır 10). miktar ilgi sadece immünfloresan stainings istihdam biyokimyasal herhangi bir yöntem kullanarak gerek kalmadan proteinlerin ve yerelleştirme için biz tarif işte yöntem sağlar. Başka bir avantaj burada miktar çok daha küçük bir alana yapılabilir ve bu nedenle, daha belirgin, bu daha başka yöntemlerle elde var. Ancak, bir güvenilir referans protein faiz protein dağılımı değerlendirmek gerektiğini dikkate almak zorunda.
Floresan immünhistokimya tarafından boyama yerelleştirme proteinlerin beyin bölgeleri arasında yanı sıra farklı nöronal bölmeleri içinde düzenli olarak tanımlamak için bize izin verir. Farklı bölmeleri tanımlamak için belirli işaretleri kullanılır. Genellikle, synapsin ve synaptophysin11 karşı antikor Fagot karşı antikor presynaptic terminal12etkin bölgenin etiket iken sinaptik veziküller, etiketlemek için kullanılabilir. Veziküler glutamat taşıyıcılar (vGluT) veya veziküler GABA ışınlama (vGAT), gibi veziküler taşıyıcılar13 eksitatör ve inhibitör14 presynaptic terminalleri, sırasıyla etiketlemek için kullanılır. Postsinaptik tarafında, Homer protein karşı antikor postsinaptik terminalleri ve postsinaptik yoğunluğu protein 95 (PSD95)15,16,17 veya gephyrin18 karşı antikor işaretlemek için istihdam edilebilir , 19 , 20 eksitatör veya inhibitör postsinaptik terminalleri, sırasıyla etiketleyebilirsiniz. Faiz ve işaretleri yukarıda açıklanan olanlar gibi bir protein karşı antikor kullanarak, bir tür protein lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Bugüne kadar birçok çalışma bu nitel şekilde21‘ yaptık. Ancak, güvenilir bir şekilde belirli bir sinaptik protein fark dağılımını belirlemek için biri sadece varlığını veya yokluğunu aynı zamanda onun göreli yoğunlaşmasını belirlemeniz gerekir değil. Sinapsların yoğunluğu ve boyutları heterojen sinaptik marker ve faiz protein arasındaki oran kurmak önemli hale getirir. Aksi takdirde, sinaps zengini bölgeleri hipokampüs piramit katmanları ve beyincik moleküler tabakası gibi yüksek yoğunluklu sinaptik proteinlerin, sinapslarda daha yüksek yoğunluk nedeniyle sadece ama bu proteinin güçlü bir varlığı nedeniyle değil gösterecektir Her synapse (Örneğin, Wallrafen ve Dresbach1). Öte yandan, nöronal soma (Örneğin, TGN3822) proteinler genelde güçlü bir varlık hipokampal piramit hücre katmanı veya hipokampal veya serebellar granül hücre katmanı nöronal hücre gövdeleri yüksek konsantrasyon nedeniyle gösterir Bu alanlarda. Bu nedenle, homojen olmayan bu dağıtım yapıları, bu durumda synapses, faiz kendisi protein dağıtımını yanlış bir tahmin için yol açabilir. Ayrıca, bir içsel değişkenlik immunohistokimyasal stainings örnekleri arasında yoğunluklarda boyama olduğunu. Burada açıklanan protokol bu dikkate alır ve immunohistokimyasal yöntemleri ortaya çıkan diğer uyarılar yanı sıra böyle önyargıları önler.
Bizim son çalışma, 16 farklı beyin alanları1arasında bu yöntem biz (TPRGL23 veya SVAP3024da denir) taşıyıcı fark ifade tanımlamak için kullanılan. Taşıyıcı Derneği sinaptik veziküller bulunabilir ve nörotransmitter yayın25,26,27etkiler, omurgalılar özgü sinaptik proteindir. Biz taşıyıcı ifade sinaptik veziküller, bereket için synaptophysin bir sinaptik vezikül başvuru işaretçisi olarak için boyama ile ilgili. Özellikle septum nükleuslar, ventral yarayan ve amigdala Mover yüksek düzeyde bulduk. Hippocampus içinde taşıyıcı, türdeş olmayan bir dağıtım içi hipokampal hesaplama ve giriş ve çıkış katmanları düşük düzeyleri ile ilgili katmanlarında yüksek seviyelerde bulduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yöntemi burada sunulan bir protein göreli bir işaretleyici protein bolluğu ilgi dağılımıyla bilinen bir dağıtım miktarının amaçlamaktadır. Ayirt boyama boyama yoğunluklarda farklı dilimleri arasında yüksek bir değişkenlik gösterebilir. Burada açıklanan miktar yaklaşım Yarımküre protein ortalama faiz oranını belirleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar. Bu nedenle, farklı boyama şiddetlerde dilimleri arasında iptal edilir ve nicel açıklamasını sağlar.
Her…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Irmgard Weiss mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Yazarlar destek Hermes Pofantis ve Andoniya Petkova tarafından kabul. Yazarlar ayrıca Avrupa Nörolojik Bilimler Enstitüsü LSM800 ve teknik destek, özellikle Dr. Nils Halbsgut tarafından kullanımı için teşekkür ederiz. Bu eser Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi nde tarafından finanse edildi. JSV nano mikroskobu ve moleküler Fizyoloji beyin (CNMPB) desteği Merkezi tarafından kabul eder.
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
