Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için
Summary
Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.
Abstract
Hücre hareketi bir kritik trophoblasts plasental geliştirme ve erken gebelik sırasında özelliğidir. Uygun Trofoblast göç ve işgal önemini anne damarlara yetersiz Trofoblast işgali ile ilişkili olan gebelik bozuklukları öncesi eklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlama gibi gösterilmiştir. Ne yazık ki, anlayışımızı mekanizmaları hangi plasenta tarafından geliştirir geçiş–dan trophoblasts sınırlıdır. Hücre göç sıfırdan tahlil ile in vitro analiz Trofoblast göçmen kapasitesini düzenleyen etkenler belirlenmesinde yararlı bir araçtır. Ancak, bu tahlil yalnız değişmiş hücre göç neden olabilir hücresel değişikliklerin tanımlamaz. Bu iletişim kuralı topluca Trofoblast hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan üç farklı tüp bebek deneyleri açıklar: sıfırdan tahlil, istila tahlil ve nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil. Burada açıklanan protokoller de bizi canlı tutan hücre hareketinde ölçmek için diğer hücre hatlarında kullanılmak değiştirilebilir. Bu yöntemler müfettişler bireysel faktörler hücre hareketine katkıda bulunmak ve potansiyel mekanizmaları hücre göç belirgin değişiklikler temel alınan bir muayene sağlar tanımlamak olanak sağlar.
Introduction
Plasental geliştirme gebelik, maternal ve fetal sağlığı etkileyen kurulması çok önemli bir adımdır. Ancak, bu işlem tarafından oluştuğu mekanik olarak tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre göç kurulması ve plasenta fonksiyonları için hamilelik sırasında yaptığı katkının önemli bir biyolojik süreçtir. Blastosist implantasyonu, Korionik villus yüzeyine kapak ve gaz ve besin değişimi dahil olan, villous trophoblasts, ve dışarı villus göç extravillous trophoblasts (EVTs), trophectoderm ayırır ve anne decidua ve damarlara1istila. EVTs geçirilmesi anne spiral arterler remodeling ve fetal büyüme2desteklemek için uteroplacental dolaşım kurulması için esastır. Yetersiz Trofoblast işgali sırasında gebelik gebelik komplikasyonları preeklampsi, Gestasyonel hipertansiyon, intra uterin büyüme kısıtlama ve erken doğum3gibi katkıda ve anormal plasental geliştirme sonuçları, 4. Bu nedenle, Trofoblast hareketliliği etkileyen faktörleri anlamak için normal placentation gerekli yollar belirlemek için önemlidir.
Trofoblast geçiş sinyal molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler, hormonlar ve anjiogenik faktörler5de dahil olmak üzere karmaşık bir ağı tarafından kontrol edilir. Plasenta içinde vivo eğitim sınırlamaları nedeniyle, tüp bebek deneyleri kullanan insan Trofoblast hücre hatları Trofoblast hareketliliği için katkıda faktörleri belirlemek için çok önemli olmuştur ölümsüzleştirdi. Sıfırdan ve işgal deneyleri kapsamlı kantitatif Trofoblast hücre göç6,7,8bireysel moleküllerin rolünü değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, tandem nasıl geçiş değişiklikleri değişiklikleri tarafından hücre invasiveness neden olabilir araştırmak için yararlı iken bu iki deneyleri değişmiş hücre geçiş oranları için katkıda bulunabilir ek mekanizmaları için hesap değil. Örneğin, hücre çoğalması oranının indirimleri daha az hücrelerde geçirmek kullanılabilir neden olabilir.
Burada, çizik, hücre çoğalması ve hücre işgali deneyleri kullanarak Trofoblast geçişi değerlendirmek için kantitatif tüp bebek yöntemleri açıklanmaktadır. Sıfırdan tahlil tek tip bir yara bir hücre monolayer oluşturulur ve geçiş hücre boşluğu doldurmak için otomatik, hızlandırılmış görüntüleme yara boyutu ve yoğunluğu yara içindeki hücreleri tarafından ölçülür. Hücre çoğalması tahlil hücreler hücreleri bilinen başlangıç miktarı karşılaştırıldığında her zaman noktasında oranını hesaplamak üzerinde temel alır. Cep işgali tahlil hücreleri bir hücre dışı matriks kaplı hücre kültür Ekle Odası (örneğin Transwell) tohumlari ve yanıt olarak kemoterapi-cezbedici hücre dışı matriks ile istila hücre sayısı dikkate alınır.
Kazı-kazan tahlil ne kadar farklı çevre koşulları belirlemek için kullanılan basit ve etkili bir araç etkileyen hücre geçiş olduğunu. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve işgal deneyleri daha sonra hücre çoğalması ve invasiveness hücre göç genel değişikliklere katkısını belirlemek için kullanılır. Toplu olarak, bu deneyleri hücre hareketliliği için katkıda bulunabilir biyolojik süreçlerin sağlam ölçümler sağlamak. İki ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre satır açıklanan deneyleri, Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10kullanılmıştır. Ancak, bu deneyleri de hücre göç ve işgal anahtar modülatörler tanımlamak için diğer hücre tipleri kullanmak için optimize.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yordamı geçiş ve işgal kullanımı deneyleri hücre çoğalması Trofoblast hücre hareketi ölçülen farklılıkları için potansiyel bir katkı olarak değeri oluşturur. Birlikte bu tüp bebek deneyleri Trofoblast geçişi düzenleyen hücresel yolları tanımlamak için kullanılan basit ve etkili yöntem kullanılır. Yukarıda açıklandığı gibi Trofoblast hücreleri hormonlar, sitokinler, büyüme faktörleri veya Trofoblast hareket üzerindeki etkilerini belirlemek için diğer molekülleri ile tedavi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Gil Mor Sw.71 hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir Albert McKern bilim adamı Ödülü S.W. tarafından desteklenmiştir
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
