Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Résumé

Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.

Résumé

Mouvement cellulaire est une propriété essentielle de trophoblastes durant le développement placentaire et début de grossesse. Les troubles de la grossesse tels que la restriction de croissance intra-utérine et de la prééclampsie, qui sont associés à l’invasion du trophoblaste inadéquate du système vasculaire maternelle attestent l’importance de la migration correcte de trophoblaste et invasion. Malheureusement, notre compréhension des mécanismes par lequel le placenta se développe de migrer trophoblaste est limitée. Analyse in vitro de la migration cellulaire via le dosage zéro est un outil utile pour identifier les facteurs qui régissent la capacité migratoire de trophoblaste. Toutefois, ce test seul ne définit pas les modifications cellulaires qui peuvent se traduire par la migration des cellules altérées. Ce protocole décrit trois différents essais in vitro utilisés collectivement pour évaluer le mouvement des cellules Trophoblastiques : le test de gratter, le dosage de l’invasion et le test de prolifération. Protocoles décrits ici peuvent également être modifiées pour utilisation dans les autres lignées de cellules afin de quantifier le mouvement cellulaire en réponse à des stimuli. Ces méthodes permettent d’identifier les facteurs individuels qui contribuent à la circulation de cellules et d’effectuer un examen approfondi des mécanismes éventuels changements apparents dans la migration cellulaire, les enquêteurs.

Introduction

Développement placentaire est une étape cruciale dans la mise en place de la grossesse, un impact sur la santé maternelle et fœtale. Toutefois, les bases mécanistiques par lesquels ce processus se produit ne sont pas entièrement comprise. La migration cellulaire est un processus biologique important qui contribue à la mise en place et les fonctions du placenta pendant la grossesse. Après l’implantation du blastocyste, le trophectoderme se différencie en villositaire trophoblastes, qui recouvrent la surface des villosités choriales et sont impliqués dans l’échange de nutriments et de gaz, et de trophoblaste extravilleux (tte), qui migrent à partir des villosités et env....

Protocole

1. préparation de la cellule

1. Maintenir les cellules dans des flacons de T-75 dans les milieux de croissance standard à 37 ° C, 5 % de CO₂et 95 % d’humidité.
   Remarque : Les cellules utilisées dans ces expériences étaient l’immortalisé les cellules Trophoblastiques au premier trimestre des lignes Swan.71 (Sw.71) et DB-8/SVneo^9,10. Les cellules Sw.71 ont été gardés en DMEM/F-12 additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), pyruvate de sodium 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM non essentiels des acides aminés, 100 unités/mL de pénicilline et 100 µg/mL ....

Résultats

Les lignées de cellules immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste HTR-8/SVneo et Sw.71 ont été utilisées lors de ces expériences pour déterminer le rôle des glucocorticoïdes dans le trophoblaste cell migration¹². Les glucocorticoïdes ont été utilisés dans ces expériences qu’elles ont été récemment montrées d’altérer les fonctions de trophoblaste, même si les traitements alternatifs peuvent être utilisé¹². Les deux lignées cellu.......

Discussion

Cette procédure s’appuie sur l’utilisation de la migration et l’invasion des essais afin d’inclure le taux de prolifération cellulaire comme un facteur potentiel de différences mesurées dans le mouvement de cellules Trophoblastiques. Utilisés ensemble, ces essais in vitro sont des méthodes simples et efficaces qui peuvent servir à identifier les voies cellulaires qui régulent la migration de trophoblaste. Comme décrit ci-dessus, cellules Trophoblastiques peuvent être traitées avec des hormones, cytokines, facteurs de cro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,4 % Trypan blue stain	Thermo Fisher Scientific	15250-061
0,5 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	15400-054
1,0 M HEPES	AmericanBio	AB06021-00100
10 mM MEM acides aminés non essentiels	Life Technologies	11140-050
100 mM pyruvate de sodium	Life Technologies	11360-070
Plaques de transpuits à 24 puits Corning		3422	Contiennent des filtres en polycarbonate avec un 8 &mu ;
de cellules automatisé Compteur de cellules automatisé	Thermo Fisher	AMQAX1000
Crystal Violet	Sigma Aldrich	C0775
Cytoseal 60	Thermo Fisher Scientific	8310-4
La dexaméthasone (Dex ; 1, 4-prégnadiène-9&alpha ;-fluoro-16&alpha ;-méthyl-11&bêta ;, 17, 21-triol-3, 20-dione ; &ge ; 98 % TLC)	Steraloids	P0500-000
DMEM/Ham' s F12	Life Technologies	11330-032
Sérum fœtal bovin	Sigma Aldrich	F2442
IncuCyte 24-well ImageLock Plates	Essen BioScience	4365	Si vous utilisez le système d’imagerie IncuCyte Zoom, ensemencez les cellules sur les plaques IncuCyte ImageLock. Ces plaques ont des marqueurs repères au bas de la plaque qui sont utilisés comme référence pour l’imagerie répétée dans un champ de vision constant.
Logiciel IncuCyte	Essen BioScience	2010A Rev2
Système IncuCyte ZOOM	Essen BioScience	N/A	Les images du test Scratch ont été capturées et analysées à l’aide du préréglage " Blessure par égratignures" sur le système IncuCyte ZOOM. D’autres microscopes time-lapse peuvent également être utilisés.
Matrigel Membrane Matrix	Becton Dickinson	356231	Facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol
Microlames	VWR International, LLC	48311-7003
Verre de protection de microscope	Fisher Scientific	12-545-E
Microscope inversé Olympus IX71	Pénicilline Olympus	IX71
(10 000 unités/mL)/streptomycine (10 000 & micro ; g/mL)	Life Technologies	151-40-122
Sans rouge de phénol DMEM/Ham’s F12	Life Technologies	11039-021
Outil de fabrication de plaies semi-automatique	Essen BioScience	N/A

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