Un protocole en acier inoxydable pour l’ARN haute qualité laser capturer des cellules de Microdissected Purkinje du cervelet humain Post-Mortem

Summary

Ce protocole utilise une approche sans tache de visualiser et d’isoler les cellules de Purkinje dans les tissus frais congelés de cervelet humain post-mortem par microdissection de saisie de laser. Ce protocole vise à produire des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour RNA-sequencing.

Abstract

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un outil avantageux qui permet la collecte de cellules cytologiquement et/ou phénotypiquement pertinentes ou régions de tissus hétérogènes. Produit capturé peut être utilisé dans une variété de méthodes moléculaires pour les protéines, isolement d’ADN ou d’ARN. Cependant, la préservation de l’ARN de tissus post-mortem de cerveau humain est particulièrement difficile. Techniques de visualisation standard pour LCM nécessitent histologique ou méthodes de coloration immunohistochimique qui peuvent encore dégradent RNA. Par conséquent, nous avons conçu un protocole en acier inoxydable pour la visualisation dans LCM avec le but de préserver l’intégrité du RNA dans le tissu de cerveau humain post-mortem. Les cellules de Purkinje du cervelet est un bon candidat pour une visualisation en acier inoxydable, en raison de sa taille et sa localisation caractéristique. Le cortex cérébelleux a couches distinctes qui diffèrent dans la densité des cellules, ce qui les rend un bon archétype d’identifier sous microscope grossissement élevé. Les cellules de Purkinje sont grands neurones situées entre la couche de cellules de granules, qui est un réseau cellulaire dense de petits neurones, et la couche moléculaire, ce qui est rare dans les corps cellulaires. Grâce à cette architecture, l’utilisation de la visualisation en acier inoxydable est faisable. Autres systèmes d’organe ou cellule qui imitent ce phénotype conviendraient également. Le protocole en acier inoxydable est conçu pour corriger les tissus frais congelés avec de l’éthanol et supprimer les lipides avec xylène pour meilleure visualisation morphologique sous microscopie optique grossissement élevé. Ce protocole ne tient pas compte d’autres méthodes de fixation et est spécialement conçu pour les échantillons de tissus frais congelés capturées à l’aide d’un rayonnement ultraviolet (UV)-système de LCM. Nous présentons ici un protocole complet pour sectionnement et fixation tissu cérébelleux humain congelé frais post mortem et purification de l’ARN des cellules de Purkinje isolées par UV-LCM, tout en préservant la qualité de RNA pour RNA-sequencing ultérieur. Dans nos mains, ce protocole produit des niveaux exceptionnels de visualisation cellulaire sans besoin de réactifs de coloration et rendements RNA avec des nombres élevés de l’intégrité des RNA (≥8) selon les besoins pour des expériences de profilage transcriptionnels.

Introduction

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un précieux outil de recherche qui permet de séparer les cellules pathologiquement pertinentes pour les évaluations subséquentes moléculairement entraînée. L’utilisation des analyses moléculaires dans ces échantillons de tissus hétérogènes et la corrélation avec les données cliniques et pathologiques est une étape nécessaire pour évaluer l’importance translationnelle de la recherche biologique¹. Lors de l’analyse des données d’expression de gène de l’ARN, l’utilisation de coupes de tissus congelés est hautement recommandée car il permet l’excellente qualité de l’ARN ainsi que maximiser la quantité². Il a été bien établi que la qualité et la quantité d’ARN sont essentiels pour des données significatives de RNA séquençage³. Toutefois, lorsque vous utilisez RNA de tissus frais congelés post mortem pour LCM, dégradation de l’ARN est un défi majeur, car il se produit immédiatement après la mort et son étendue est médiée par des facteurs divers associés avec les tissus collection méthode^4,5 . En outre, dégradation de l’ARN est exacerbée lorsque des techniques de coloration sont nécessaires pour reconnaître les détails histologiques et l’identification de la cellule. Spécialisée de coloration des techniques telles que l’hématoxyline et éosine, teinté de Nissl, immunofluorescence et l’immunohistochimie sont utiles pour différencier les cellules du stroma environnant, mais auraient dû être divulgués à dégrader RNA et modifier l’expression de la transcription ⁶de profils. Par conséquent, notre laboratoire a créé un protocole en acier inoxydable spécialement conçu pour préserver les RNA dans post mortem cervelet humain aux fins de séquençage de RNA après isolement de LCM des neurones de Purkinje.

Dans le traitement des tissus congelés frais pour LCM, la méthode de fixation peut affecter variablement d’intégrité d’ARN et de tissus. Fixation de formol est standard pour la préservation morphologique, mais causes réticulation qui peuvent fragmenter RNA et nuire à la RNA amplification⁷. Fixation de l’éthanol est une meilleure alternative pour les ARN, comme c’est un fixateur coagulantes qui n’induit pas de réticulation¹. Afin d’améliorer la visualisation de la morphologie tissulaire, xylène est le meilleur choix, car il supprime des lipides dans les tissus. Cependant, il existe connus des limitations lors de l’utilisation de xylène dans LCM, car les tissus peuvent sécher et devenir cassant causant fragmentation de tissu sur laser capture⁷. Xylène est aussi une toxine volatile et doit être manipulé correctement sous une hotte. Néanmoins, le xylène a été démontré pour améliorer la visualisation des tissus tout en préservant l’intégrité de RNA⁸. Par conséquent, notre protocole est centrée autour de l’utilisation de la fixation de l’éthanol 70 % et de déshydratation de l’éthanol, suivie d’incubation xylène pour plus de clarté morphologiques.

Il est important de noter les différents types de systèmes de microdissection laser-basé, comme ils auraient dû être divulgués diffèrent en vitesse, précision et qualité de RNA. Laser infrarouge (IR) capture microdissection et les systèmes microdissection des microfaisceaux de laser ultraviolets (UV) étaient les deux plates-formes de LCM nouveaux qui ont émergé, presque en même temps,⁸. Le système IR-LCM emploie un « système de contact » à l’aide d’un film thermoplastique transparent placé directement sur la section de tissus et cellules d’intérêt sélectivement adhèrent au film par impulsions ciblées d’un laser IR. Alternativement, le système UV-LCM est un « système de non-contact » par laquelle un faisceau laser focalisé coupe loin des cellules ou des régions d’intérêt dans le tissu ; Selon la configuration à deux plates-formes commerciales actuellement disponibles qui utilisent soit un design microscope inversé ou redressée, tissu est acquis dans un dispositif de collecte par une onde de pression induite par laser qu’il propulse contre la gravité ou le tissu est recueillis par gravité, respectivement. Des avantages significatifs du système UV-LCM incluent accélérer l’acquisition cellulaire, collection sans contamination avec l’approche sans contact et une dissection plus précise grâce à un beaucoup plus petit laser faisceau de diamètre⁹. Ce protocole a été spécialement conçu pour un système UV-LCM et n’a pas été testé dans un système IR-LCM. Soit design du système UV-LCM, lorsque les cellules s’accumulent dans le capuchon de la collection, l’utilisation d’une lamelle qui améliore la clarté cellulaire au cours de la microscopie ne convient pas, car les cellules seraient incapables d’entrer dans le plafond de la collection. Par conséquent, pour améliorer la visualisation des tissus, nous avons testé l’utilisation de bouchons collection Opaque, qui sont conçus pour agir comme un lamelle couvre-objet pour visualisation microscopique dans les systèmes UV-LCM, contre casquettes collection remplie liquide. Casquettes de la collection remplie liquide peuvent être difficile, car le liquide est soumise à l’évaporation et doit être remplacé fréquemment alors qu’il travaillait au microscope. Le temps devient un facteur important pour la stabilité du RNA, comme le tissu capturé dissout immédiatement⁷.

Notre laboratoire étudie les changements neuropathologique post-mortem dans le cervelet des patients atteints de tremblement essentiel (he) et neurodégénératives apparentées du cervelet. Nous avons démontré de modifications morphologiques centrées sur des cellules de Purkinje qui distinguent ET cas par rapport aux contrôles, y compris un réduction du nombre de cellules de Purkinje, a augmenté de régression dendritique et une variété de changements axonales, qui nous conduit à postuler que Purkinje dégénérescence des cellules est une fonctionnalité de base biologique ET pathogenèse^10,11,12,13. Transcription de profilage a été utilisé dans de nombreuses maladies neurologiques pour explorer les bases moléculaires sous-jacents des changements cellulaires dégénératifs. Cependant, profils transcriptionnelles des échantillons hétérogènes, tels que des régions de tissus du cerveau, peuvent effectivement masquer l’expression de transcriptions de faible abondance et/ou diminuer la détection des changements moléculaires qui se produisent uniquement dans une petite population de touchés cellules, telles que les cellules de Purkinje du cortex cérébelleux. Par exemple, des cellules de Purkinje sont largement dépassés en nombre par les cellules de granules abondante dans le cortex cérébelleux par environ 1 : 3000 ; ainsi, pour cibler efficacement leur transcriptome exige l’isolation spécifique de ces neurones. Le cortex cérébelleux est délimité par des couches distinctes qui diffèrent dans la densité cellulaire et la taille des cellules. Cette architecture cellulaire est idéale pour visualiser dans un échantillon de tissus frais congelés sans réactifs de coloration contenant du colorant. En théorie, ce protocole pourrait également être appliqué à d’autres types de tissus qui ont même tissu distinctif organisation.

Ce protocole a été conçu pour fonctionner spécifiquement pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem. Plusieurs protocoles existent pour la fixation, la coloration de la visualisation et la préservation de RNA de nombreux types de tissus aux fins des deux IR et UV-LCM. Lorsque l’on envisage un plan expérimental pour UV-LCM, individus devraient adapter leur protocole au mieux les besoins et exigences de début et de fin des matériaux. Ici, nous combinons plusieurs aspects de différents protocoles de LCM pour fournir une méthode améliorée pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post mortem sans avoir besoin de colorant contenant des réactifs de coloration pour préparer l’ARN de haute qualité pour transcriptome séquençage.

Protocol

Tous les échantillons humains utilisés dans le présent protocole ont été obtenus avec le consentement éclairé et ont été approuvés par l’interne Review Board (IRB) de Columbia University et l’Université de Yale. Remarque : L’intégralité du présent protocole doit suivre RNA stricte gestion des lignes directrices, auquel cas une main gantée est toujours utilisée, toutes les surfaces sont nettoyées avec un décontaminant RNase et tous les documents de trav…

Representative Results

Ce protocole détaille les étapes pour la préparation des tissus cérébraux humains congelés frais post mortem pour UV-LCM. Annotations et spécifications approfondies sont données pour la découpe du cryostat, comme il peut être difficile de couper le tissu cérébral congelées fraîches avec un degré élevé de précision. Le point le plus important à considérer est que les tissus frais congelés est extrêmement froid et nécessite une quantité importante de temps pour s’a…

Discussion

Le protocole présenté ici est spécialement modifié pour être une approche inox en visualisant les tissus morphologiquement distinctes pour UV-LCM. Cette méthode est conçue pour maximiser l’intégrité RNA pour ultérieur séquençage direct de RNA, tout en conservant un niveau de visualisation des tissus. La capacité de distinguer les différents types de cellules pour la capture, pour créer la plus pure population de cellules possible, est indispensable pour comprendre les différents profils moléculaires da…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.