दो-फ्लोरोक्रोम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सात प्रतिरक्षा सेल सबसेट का भेदभाव
Summary
यहां, हम एक प्रवाह cytometric प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और मानव परिधीय रक्त में monocytes सात के बजाय केवल दो fluorochromes का उपयोग करके । इस दृष्टिकोण के साथ, पांच अतिरिक्त मार्कर सबसे फ्लो cytometers पर दर्ज किया जा सकता है ।
Abstract
प्रतिरक्षा सेल लक्षण वर्णन भारी बहुरंगा प्रवाह cytometry सतह मार्कर के अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर उपआबादियों की पहचान करने पर निर्भर करता है । एक क्लासिक बहुरंगा पैनल के सेटअप उच्च अंत उपकरणों, कस्टम लेबल एंटीबॉडी, और सावधान अध्ययन डिजाइन स्पेक्ट्रल ओवरलैप को कम करने के लिए की आवश्यकता है. हम एक multiparametric विश्लेषण विकसित की पहचान करने के लिए प्रमुख मानव प्रतिरक्षा आबादी (सीडी 4+ और सीडी 8+ t कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes) परिधीय रक्त में सात वंश मार्करों के संयोजन के द्वारा केवल दो fluorochromes का उपयोग कर. हमारी रणनीति अवलोकन है कि वंश मार्करों लगातार प्रत्येक कोशिका जनसंख्या द्वारा एक अनूठा संयोजन में व्यक्त कर रहे है पर आधारित है । एंटीबॉडी के एक सावधान टाइट्रेट के साथ इस जानकारी के संयोजन जांचकर्ताओं के लिए पांच अतिरिक्त मार्कर रिकॉर्ड की अनुमति देता है, सबसे प्रवाह cytometers के ऑप्टिकल सीमा का विस्तार । सिर से सिर की तुलना का प्रदर्शन किया है कि परिधीय रक्त में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के विशाल बहुमत हमारे विधि और क्लासिक “एक fluorochrome-एक मार्कर दृष्टिकोण” के बीच तुलनीय सटीकता के साथ विशेषता हो सकती है, हालांकि बाद अभी भी ऐसे nkt कोशिकाओं और γδ T कोशिकाओं के रूप में आबादी की पहचान करने के लिए और अधिक सटीक । दो फ्लोरोक्रोम्स का उपयोग कर सात मार्कर का संयोजन सस्ती 6-10 fluorochrome प्रवाह cytometers पर जटिल प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, और यहां तक कि सीमित संसाधनों के साथ क्षेत्रों में 2-3 fluorochrome क्षेत्र उपकरणों पर । उच्च अंत उपकरणों भी अतिरिक्त फ्लोरोक्रोमेज़ का उपयोग करने के लिए गहरी प्रवाह cytometry विश्लेषण को पूरा करके इस दृष्टिकोण से लाभ उठा सकते हैं । यह दृष्टिकोण भी बहुत अच्छी तरह से कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नैदानिक नमूनों के मामले में कई कोशिका आबादी स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल है ।
Introduction
प्रवाह cytometry एक तकनीक है कि प्रति सेकंड1घटनाओं के कई हजार की दर से एकल कणों पर कई मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था । प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण नमूनों के उदाहरणों में शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, कोशिकाओं, मोती, बैक्टीरिया, vesicles और गुणसूत्रों. एक fluidic प्रणाली पूछताछ बिंदु पर कणों निर्देश जहां प्रत्येक कण एक या एक से अधिक लेसरों के साथ अपने रास्ते intersects, और कई मापदंडों आगे के विश्लेषण के लिए दर्ज कर रहे हैं. आगे और पक्ष scatters, शुद्ध लेजर प्रकाश के प्रकीर्णन द्वारा उत्पंन, लक्ष्य जनसंख्या की पहचान करने और संबंधित आकार और आंतरिक जटिलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है/ सभी अंय मापदंडों, कि एक प्रवाह cytometric विश्लेषण में डेटा के अधिकांश के लिए खाते, fluorochrome द्वारा व्युत्पंन-लेबल जांच कि पहचान और ब्याज के कणों पर विशिष्ट लक्ष्यों को बांध रहे हैं ।
प्रवाह cytometry प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए एक प्राथमिक उपकरण की पहचान करने और कोशिका आबादी की विशेषता है । प्रतिरक्षा प्रणाली की जटिलता को काटना, बहुरंगा पैनलों लगातार एक साथ सेल आबादी1के गहरे immunophenotyping के लिए दर्ज मार्कर की संख्या का विस्तार करने के लिए विकसित कर रहे हैं । यह 20 फ्लोरोसेंट मापदंडों से अधिक हाल ही में उच्च अंत प्रवाह cytometers के साथ अधिक सक्षम उपकरणों और फ्लोरोक्रोमीस के विकास के लिए अग्रणी है । फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रल ओवरलैप के कारण और कस्टम एंटीबॉडी लेबलिंग और कुशल ऑपरेटरों के साथ जुड़े उच्च लागत में जटिल अध्ययन डिजाइन में यह परिणाम है । कई उदाहरणों में, जटिलता और लागत अलग सेल आबादी के लिए मार्कर के अलग पैनलों का उपयोग करके कम कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण, तथापि, त्रुटि प्रवण है, प्रत्येक पैनल में जानकारी कम कर देता है, और कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नमूनों पर लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा, मार्करों की संख्या में वृद्धि कम फ्लोरोसेंट मापदंडों के साथ उपकरणों पर गहरी immunophenotyping precludes । हम पहले एक धुंधला प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए प्रमुख मानव प्रतिरक्षा आबादी की पहचान (सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes) परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं में (pbmcs) के संयोजन के द्वारा सात वंश मार्कर का उपयोग सात के बजाय केवल दो fluorochromes पारंपरिक “एक fluorochrome-एक मार्कर” दृष्टिकोण (www.hcdm.org)2,3का उपयोग करने की आवश्यकता है । हमारी प्रारंभिक रिपोर्ट का पता लगाया और गहरी immunophenotyping के लिए दो फ्लोरोक्रोम में सात मार्कर के संयोजन की धारणा को मान्य. इस रिपोर्ट में, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल को अलग करने और परिधीय रक्त कोशिकाओं दाग, व्यावहारिक पहलू पर ध्यान केंद्रित करने और एक सफल धुंधला प्राप्त करने के लिए समस्या निवारण कदम प्रस्तुत करते हैं ।
इस प्रोटोकॉल अवलोकन है कि वंश मार्कर कोशिका की सतह पर एक निरंतर अभिव्यक्ति है पर आधारित है और है कि प्रत्येक कोशिका आबादी वंश मार्कर का एक विशेष संयोजन है । pbmcs में, सीडी3 अभिव्यक्ति प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दो मुख्य श्रेणियों में उपविभाजित करती है: cd3-पॉजिटिव टी लिम्फोसाइटों और सीडी3-निगेटिव सेल । CD3 सकारात्मक उपसमूह के भीतर, सीडी 4+, सीडी 8+ और γδ T कोशिकाओं एंटीबॉडी है कि केवल सीडी 4, सीडी 8 और γδ रिसेप्टर लक्ष्य का उपयोग कर अलग किया जा सकता है । एक तुलनीय तरीके में, CD3 नकारात्मक उपसमूह के भीतर, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes CD19, CD56 और CD14, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर विशिष्ट रूप से पहचाना जा सकता है. एक मानक एक fluorochrome में-एक मार्कर दृष्टिकोण, विरोधी CD3,-सीडी 4,-सीडी 8,-CD14,-CD19,-CD56 और-tcr γδ एंटीबॉडी सात अलग fluorochromes के साथ पता चला रहे हैं । हमारे दृष्टिकोण विरोधी CD3,-CD56, और tcr γδ एंटीबॉडी एक फ्लोरोक्रोम में (सुविधा फ्लोरोक्रोम ए के लिए लेबल) और विरोधी सीडी 4,-सीडी 8, CD14 और-CD19 एक अलग fluorochrome (फ्लोरोक्रोम बी) में एंटीबॉडी । यह एंटीबॉडी टाइट्रेट और अंतर antigen अभिव्यक्ति का एक संयोजन के द्वारा संभव है । दोनों सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं fluorochrome एक में विरोधी CD3 एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन वे फ्लोरोक्रोम बी में अलग किया जा सकता है सीडी 8 संकेत की अभिव्यक्ति अधिकतम जबकि रखने, एक तदर्थ टाइट्रेट करने के साथ, में सीडी 4 संकेत सीडी 8 के बीच और इस CD3 सकारात्मक-सीडी 4/सीडी 8 डबल नकारात्मक कोशिकाओं । γδ T कोशिकाओं सीडी4और सीडी 8 से सीडी3 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है, और इसलिए वे के रूप में पहचाना जा सकता है cd3 उच्च 4. इस संकेत को एक एंटी-टीसीआर γδ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोक्रोम ए में γδ टी कोशिकाओं को लेबलिंग द्वारा बढ़ाया जाता है, इस प्रकार cd3 कम टी कोशिकाओं और cd3 उच्च γδ टी कोशिकाओं के बीच जुदाई में सुधार होता है । बी कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है CD3– में fluorochrome एक और CD19+ फ्लोरोक्रोम बी में । बी कोशिकाओं से CD3 नकारात्मक nk कोशिकाओं को अलग करने के लिए, एक anti-CD56 एंटीबॉडी का उपयोग फ्लोरोक्रोम ए में एंटी-सीडी3 के रूप में किया गया था । यह संभव है क्योंकि CD56 T कोशिकाओं पर सीडी3 की तुलना में एक बहुत निचले स्तर पर nk सेल पर व्यक्त किया है5. अंत में, monocytes फॉरवर्ड साइड तितर बितर गुण और CD14 की अभिव्यक्ति में fluorochrome बी के संयोजन के माध्यम से पहचाना जा सकता है ।
अप करने के लिए चार मार्कर का उपयोग करने के लिए संयोजन के विचार दो फ्लोरोक्रोम पहले से ही सफलतापूर्वक करने का प्रयास किया गया है6,7,8, और एक नैदानिक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है घातक लिम्फोसाईटिक आबादी 9 की पहचान करने के लिए . एक पिछली रिपोर्ट भी (मार्कर से हम हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया से अलग विशिष्टता के साथ) सात मार्कर संयुक्त दो fluorochromes का उपयोग कर, लेकिन इस दृष्टिकोण fluorochrome10की मात्रा बदलती के साथ प्रत्येक एंटीबॉडी के एक जटिल लेबलिंग पर भरोसा किया । यह हमारी विधि है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करता है और साधन विंयास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और बहुलक fluorochromes की नई पीढ़ी का लाभ ले सकते है के विपरीत है ।
इस पद्धति का समग्र लक्ष्य के लिए सबसे अधिक प्रवाह cytometers पांच अतिरिक्त मार्कर की रिकॉर्डिंग के लिए जटिल सेल आबादी पूछताछ की अनुमति के ऑप्टिकल सीमा का विस्तार है । नतीजतन, उन्नत इम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण सस्ती 6-10 फ्लोरोक्रोम फ्लो साइटोमीटर पर किया जा सकता है, और 2-3 फ्लोरोक्रोम फील्ड इंस्ट्रूमेंट्स सीमित संसाधनों वाले क्षेत्रों में उल्लेखनीय परिणाम प्राप्त कर सकते हैं । उच्च अंत उपकरणों को भी अतिरिक्त फ्लोरोक्रोमेन्स का उपयोग करने के लिए गहरी प्रवाह cytometry विश्लेषण को पूरा करने और एक ही समय में कई प्रजातियों को लक्षित करने के लिए मॉड्यूलर प्रवाह cytometry पैनलों बनाने के द्वारा इस दृष्टिकोण से लाभ कर सकते हैं11. यह संभावित मॉड्यूलर immunophenotyping प्रवाह cytometry में इस्तेमाल पैनलों की संख्या को कम करने और लागत, त्रुटियों और हैंडलिंग समय कम कर सकते हैं । यह दृष्टिकोण भी बहुत अच्छी तरह से कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नैदानिक नमूनों के मामले में अनुकूल है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल काफी लचीला और धुंधला बफर, तापमान और परिधीय रक्त कोशिका सेल सतह पर वंश मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति की वजह से तैयारी में परिवर्तन के लिए असंवेदनशील होना दिखाया गया है । उच्च गुणव…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, , पुरस्कार संख्या P30-AR053503; stabler फाउंडेशन, www.stablerfoundation.org; राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; नीना आयरलैंड फेफड़ों के स्वास्थ्य के लिए कार्यक्रम (niplh), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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