Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.
Abstract
Caracterização de células imunes depende fortemente de citometria de fluxo multicolor para identificar subpopulações baseadas na expressão diferencial de marcadores de superfície. A instalação de um painel multicolor clássico exige instrumentos high-end, anticorpos etiquetados personalizados e cuidadoso estudo design para minimizar a sobreposição espectral. Desenvolvemos uma análise Multiparamétrico para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) no sangue periférico pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas dois fluorochromes. Nossa estratégia é baseada na observação de que marcadores de linhagem constantemente são expressos em uma combinação única de cada população de células. Combinar essas informações com uma titulação cuidadosa dos anticorpos permite que os investigadores gravar cinco marcadores adicionais, ampliando o limite óptico da maioria dos citômetros. Head-to-comparação demonstrou que a grande maioria das populações de células imunes no sangue periférico pode ser caracterizada com precisão comparável entre nosso método e a clássico “abordagem um fluorocromo-um marcador”, embora este último ainda é mais precisos para a identificação de populações, tais como células NKT e γδ T células. Combinar sete marcadores usando dois fluorochromes permite a análise de populações de células imunes complexos e amostras clínicas em 6-10 acessível fluorocromo citômetros e até mesmo em instrumentos de campo 2-3 fluorocromo em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda. Essa abordagem também é muito bem adequada para a seleção de várias populações de células, no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.
Introduction
Citometria de fluxo é uma técnica que foi desenvolvida para analisar vários parâmetros em partículas simples a uma taxa de vários milhares de eventos por segundo1. Exemplos de espécimes analisados por citometria de fluxo incluem, mas não estão limitados a, células, miçangas, bactérias, vesículas e cromossomos. Um sistema fluídico direciona as partículas no ponto de interrogação, onde cada partícula cruza seu caminho com lasers de um ou mais, e vários parâmetros são gravados para posterior análise. Espalha para a frente e lateral, gerada pela dispersão da luz do laser puro, é usadas para identificar a população-alvo e recuperar informações sobre o tamanho relativo e a complexidade interna/granularidade de partículas, respectivamente. Todos os outros parâmetros, que representam a maioria dos dados em uma análise do fluxo cytometric, são derivados pelo fluorocromo-rotulado de sondas que reconhecem e ligam para alvos específicos das partículas de interesse.
Citometria de fluxo é uma principal ferramenta para estudos imunológicos identificar e caracterizar as populações de células. Para dissecar a complexidade do sistema imunológico, multicoloridos painéis estão constantemente evoluindo para ampliar o número de marcadores simultaneamente gravada para immunophenotyping profunda da célula populações1. Isso está levando ao desenvolvimento de instrumentos mais capazes e fluorochromes, com recentes citômetros high-end, excedendo 20 parâmetros fluorescentes. Isso resulta em projeto de estudo complexo devido à sobreposição espectral fluorocromo e em custos mais elevados associados com operadores qualificados e rotulagem de anticorpo personalizado. Em vários casos, complexidade e os custos são reduzidos usando painéis separados de marcadores para populações de células diferentes. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a erros, reduz as informações em cada painel e pode ser difícil de aplicar a amostras com um número limitado de células. Além disso, aumentar o número de marcadores impede profunda immunophenotyping em instrumentos com menos parâmetros fluorescentes. Anteriormente desenvolvemos um protocolo de coloração para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas duas fluorochromes em vez dos sete necessário usando o tradicional “um fluorocromo-um marcador” abordagem (www.hcdm.org)2,3. Nosso relatório inicial explorado e validado a noção da combinação de sete marcadores em dois fluorochromes para immunophenotyping profundo. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo passo a passo para isolar e manchar as células do sangue periféricas, enfocando o aspecto prático e solução de problemas etapas para alcançar uma coloração bem sucedida.
Este protocolo é baseado na observação de que os marcadores de linhagem tem uma expressão constante na superfície das células e que cada população de células tem uma exclusiva combinação de marcadores de linhagem. Em PBMC, CD3 expressão subdivide as células imunes em duas categorias principais: linfócitos T CD3 positivo e células CD3-negativo. Dentro do subgrupo positivo CD3, CD4+, CD8+ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente. Em uma abordagem padrão um fluorocromo-um marcador, anti-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19-CD56 e – TCR γδ anticorpos são detectados com sete diferentes fluorochromes. Nossa abordagem combina anti-CD3 – CD56 e anticorpos de – TCR γδ em um fluorocromo (rotulada para fluorocromo conveniência A) e anti-CD4,-CD8, – CD14 e – CD19 anticorpos em um fluorocromo diferente (fluorocromo B). Isto é possível por uma combinação de titulação de anticorpos e expressão diferencial do antígeno. Ambos os CD4+ e CD8+ T células são positivas para o anticorpo anti-CD3 em fluocromo A, mas eles podem ser separados em fluorocromo B maximizar a expressão do sinal CD8 ao colocar, com uma titulação ad hoc, o sinal de CD4 entre o CD8 e as células de CD3 positivo-CD4/CD8 dupla negativa. As pilhas de T do γδ expressa o nível superior de CD3 CD4 e CD8, e, portanto, eles podem ser identificados como CD3 alta4. Este sinal é ainda mais impulsionado pela rotulagem γδ células T em fluocromo A com um anticorpos anti-TCR γδ, melhorando assim, a separação entre as pilhas de T CD3 baixas e as células de alta γδ T CD3. As células B podem ser identificadas como CD3– no fluocromo A e CD19+ em fluorocromo B. Para separar pilhas NK CD3 negativas de células B, um anticorpo anti-CD56 foi usado em fluocromo A como o anti-CD3. Isso é possível porque o CD56 expressa na célula NK em um nível muito inferior CD3 na T células5. Finalmente, os monócitos podem ser identificados através de uma combinação de propriedades de dispersão de lado para a frente e expressão de CD14 em fluorocromo B.
A ideia de combinar até quatro marcadores usando dois fluorochromes tem sido tentada já com êxito antes de7,6,8e tem sido usada em um protocolo clínico para identificar populações linfocítica malignas9 . Um relatório anterior combinada também sete marcadores (com diferente especificidade dos marcadores do que usamos em nosso protocolo) usar dois fluorochromes, mas esta abordagem baseou-se em um complexo de rotulagem de cada anticorpo com quantidade variável de fluorocromo10. Isto está em contraste com o nosso método que utiliza anticorpos comercialmente disponíveis e pode ser adaptado para a configuração do instrumento e pode tirar proveito da nova geração de fluorochromes de polímero.
O objetivo geral desta metodologia é expandir os limites ópticos da maioria dos citômetros, permitindo a gravação de cinco marcadores adicionais para interrogar populações de células complexas. Como consequência, avançado análise imunológica pode ser realizada em 6-10 acessível fluorocromo citômetros, e instrumentos de campo 2-3 fluorocromo podem alcançar resultados notáveis em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda e criar modular fluxo cytometric painéis como alvo várias linhagens no mesmo tempo11. Potencialmente, isso pode reduzir o número de painéis utilizados em citometria de fluxo immunophenotyping modular e reduzir custos, erros e tempo de manuseio. Essa abordagem também é muito bem adequada no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado aqui tem demonstrado ser bastante flexível e insensível às mudanças de coloração, o amortecedor, a temperatura e a preparação de células do sangue periférico, devido a alta expressão de marcadores de linhagem na superfície das células. O passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos é a titulação de anticorpos. Digno de nota, desde que a titulação de anticorpos deve sempre ser executada durante a instalação de um painel de fluxo cytomet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de artrite e doenças de pele e osteomuscular , prêmio número P30-AR053503; A Fundação Stabler, www.stablerfoundation.org; Nacionais Instituto de alergia e doenças infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irlanda programa para saúde de pulmão (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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