Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs
Summary
Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist es, zu zeigen, wie Mikroumgebungsmikroarrays (MEMA) hergestellt und verwendet werden können, um die Auswirkungen von Tausenden von einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen auf den Phänotyp kultivierter Zellen abzufragen.
Abstract
Das Verständnis der Auswirkungen der Mikroumgebung auf den Phänotyp von Zellen ist aufgrund der komplexen Mischung sowohl aus löslichen Wachstumsfaktoren als auch matrixassoziierten Proteinen in der Mikroumgebung in vivo ein schwieriges Problem. Darüber hinaus verwenden leicht verfügbare Reagenzien für die Modellierung von Mikroumgebungen in vitro in der Regel komplexe Mischungen von Proteinen, die unvollständig definiert sind und unter der Variabilität von Charge zu Charge leiden. Die Microenvironment Microarray (MEMA)-Plattform ermöglicht die Bewertung tausender einfacher Kombinationen von Mikroumweltproteinen für ihre Auswirkungen auf zelluläre Phänotypen in einem einzigen Test. Die MEMAs werden in Brunnenplatten hergestellt, was die Zugabe einzelner Liganden ermöglicht, um Brunnen zu trennen, die arrayierte extrazelluläre Matrixproteine (ECM) enthalten. Die Kombination des löslichen Liganden mit jedem gedruckten ECM bildet eine einzigartige Kombination. Ein typischer MEMA-Assay enthält mehr als 2.500 einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen, denen Zellen in einem einzigen Assay ausgesetzt sind. Als Testfall wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf der MEMA-Plattform plattiert. Die Analyse dieses Assays identifizierte Faktoren, die das Wachstum und die Proliferation dieser Zellen sowohl verbessern als auch hemmen. Die MEMA-Plattform ist hochflexibel und kann für den Einsatz mit anderen biologischen Fragen über die Krebsforschung hinaus erweitert werden.
Introduction
Die Kultivierung von Krebszelllinien auf Kunststoff in zweidimensionalen (2D) Monolayern bleibt eines der Wichtigsten Arbeitspferde für Krebsforscher. Jedoch, die Mikroumgebung wird zunehmend für seine Fähigkeit, zelluläre Phänotypen zu beeinflussen erkannt. Bei Krebs, die Tumor-Mikroumgebung ist bekannt, mehrere zelluläre Verhaltensweisen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Überleben, Invasion, und Reaktion auf Therapie1,2. Herkömmliche monolayer Zellkulturen haben in der Regel keine Mikroumgebungseinflüsse, was zur Entwicklung komplexerer dreidimensionaler (3D) Assays zum Wachsen von Zellen geführt hat, einschließlich kommerziell erhältlicher gereinigter Kellermembranextrakte. Diese gereinigten Matrizen sind jedoch in der Regel kompliziert zu verwenden und leiden unter technischen Problemen wie Chargenvariabilität3 und komplexen Zusammensetzungen3. Infolgedessen kann es schwierig sein, bestimmten Proteinen, die sich aufzelluläre Phänotypen auswirken können, eine Funktion zuzuweisen 3 .
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir die Microenvironment Microarray (MEMA) Technologie entwickelt, die die Mikroumgebung auf einfache Kombinationen von extrazellulärer Matrix (ECM) und löslichen Wachstumsfaktorproteinenreduziert 4,5 . Die MEMA-Plattform ermöglicht die Identifizierung dominanter Mikroumweltfaktoren, die das Verhalten von Zellen beeinflussen. Mithilfe eines Arrayformats können Tausende von Kombinationen von Mikroumgebungsfaktoren in einem einzigen Experiment ermittelt werden. Das hier beschriebene MEMA hinterfragt 2.500 verschiedene einzigartige Mikroumgebungsbedingungen. ECM-Proteine, die in Brunnenplatten gedruckt werden, bilden Wachstumspads, auf denen Zellen kultiviert werden können. Lösliche Liganden werden einzelnen Brunnen zugesetzt, wodurch an jedem einzelnen Ort, dem die Zellen ausgesetzt sind, einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen (ECM + Ligand) entstehen. Zellen werden für mehrere Tage kultiviert, dann fixiert, gefärbt und abgebildet, um zelluläre Phänotypen als Ergebnis der Exposition gegenüber diesen spezifischen Mikroumgebungskombinationen zu bewerten. Da es sich bei den Mikroumgebungen um einfache Kombinationen handelt, ist es einfach, Proteine zu identifizieren, die große phänotypische Veränderungen in den Zellen antreiben. MEMAs wurden erfolgreich verwendet, um Faktoren zu identifizieren, die mehrere zelluläre Phänotypen beeinflussen, einschließlich derjenigen, die Entscheidungen über das Zellschicksal und die Reaktion auf Therapie4,5,6,7vorantreiben. Diese Reaktionen können in einfachen 2D-Experimenten validiert und dann unter Bedingungen beurteilt werden, die die Komplexität der Tumormikroumgebung vollständiger rekapitulieren. Die MEMA-Plattform ist sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von Zelltypen und Endpunkten, vorausgesetzt, dass gute phänotypische Biomarker verfügbar sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bedeutung von “Dimensionalität” und Kontext war ein motivierender Faktor bei der Entwicklung von In-vitro-Kultursystemen als Werkzeuge für die Charakterisierung von Krebszellen durch ihre Interaktion mit der Mikroumgebung11und die Fähigkeit von In-vitro-Kultursystemen Kultursysteme, um die in vivo-Umgebung nachzuahmen, sind eine treibende Kraft hinter dem Streben, diese Kultursysteme zu verbessern. In-vitro-Systeme bleiben jedoch wichtige Instrumente der Krebsforschung gerade wegen ihrer F?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NIH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS) gefördert, die HG008100 (J.W.G., L.M.H. und J.E.K.) gewährte.
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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