Un ensayo de comunicación Unión intercelular yoduro amarillo fluorescente proteína-Gap
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de comunicación intercelular cruce nuevo espacio diseñado para el cribado de alto rendimiento de productos químicos modulación de ensambladura de gap para el descubrimiento de medicamentos y evaluación toxicológica.
Abstract
Uniones comunicantes (GJs) son canales de la membrana de la célula que permiten difusión de moléculas más pequeñas que 1 kDa entre células adyacentes. Ya que tienen funciones fisiológicas y patológicas, hay necesidad de high-throughput screening (HTS) ensayos para identificar moduladores GJ en ensayos de toxicología y descubrimiento de drogas. Un ensayo de novela yoduro amarillo fluorescente proteína-gap comunicación Unión intercelular (I-YFP-GJIC) satisface esta necesidad. Es un ensayo basado en células como aceptor y donante de las células que están diseñadas para expresar estable una variante de la proteína amarilla fluorescente (YFP), cuya fluorescencia sensible se apaga por yoduro o SLC26A4, un transportador de yoduro, respectivamente. Cuando el yodo se añade a un cultivo mixto de los dos tipos celulares, entran en las células donantes vía el transportador SLC26A4 y difusa a las células adyacentes aceptador via GJs donde apaga la fluorescencia de YFP. Fluorescencia de YFP se mide bien por bien en un modo cinético. La tasa de amortiguamiento YFP refleja actividad GJ. El ensayo es fiable y rápida para HTS Se describe el protocolo para el ensayo de YFP-GJIC utilizando las células LN215, las células de glioma humano.
Introduction
Uniones comunicantes (GJs) actúan como Canales intercelulares que permiten la difusión de moléculas pequeñas de < 1 kDa como nutrientes, metabolitos y moléculas de señalización entre células adyacentes. Los elementos de Unión incluyen un hemichannel o connexon en cada célula, y cada connexon constituye seis conexinas (Cxs)1. GJs y Cxs se han utilizado en los ensayos de Toxicología de carcinógenos como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), que son inhibidores GJ2,3,4. GJIC interrumpida se ha asociado con nongenotoxic carcinogénesis5,6. Como una diana terapéutica potencial, participación de GJ se ha divulgado en particular subtipos de convulsiones7,8, protección cardiaca y cerebro isquemia/reperfusión lesiones9, migraña con aura10, lesión hepática inducida por drogas6,11y12de cicatrización. Ensayos de high-throughput screening (HTS) son necesarios para identificar productos químicos modulación de GJ o anticuerpos para el descubrimiento de medicamentos, para los ensayos de Toxicología e identificar nuevos celulares reguladores de actividad GJ. Ensayos HTS pueden utilizarse también para investigar las relaciones estructura-actividad de GJ moduladores2,13,14,15.
Algunos ensayos GJIC incluyen transferencia de tinte o técnicas de sujeción de doble parche. Lucifer amarillo CH (LY) y éster acetoxymethyl de calceína (calceína-AM) se han utilizado en los ensayos de transferencia del tinte. Las células no son permeables a LY, que es introducido por microinyección, carga del rascado o electroporación. Una vez dentro de la célula, LY se extiende en vecino las células vía GJs y actividad GJ es analizado por la magnitud de la migración LY del16. Ensayos de calceína-AM implican generalmente recuperación de gap-Fluorescencia Tras Fotoblanqueo17,18. Calceína-AM es un colorante florescente de la célula que se convierte intracelularmente en calceína impermeable por una esterasa intrínseca. El ensayo requiere de un microscopio confocal para observar a la transferencia de calceína-AM en un celular de los que lo rodean después de photobleaching láser. Si GJs funcionales están presentes, calceína-AM en células adyacentes entra en las células photobleached y la fluorescencia se recupera. Actividad GJ es analizado por el grado de recuperación de fluorescencia de las células photobleached. Ensayos de transferencia del tinte están laborioso y desperdiciador de tiempo o tienen baja sensibilidad. Doble parche es un método electrofisiológico que mide conductancia junctional. Es relativamente sensible, con una dependencia directa de la conductancia en el número de GJs abierto19; sin embargo, es técnicamente exigente, lento y costoso20. El ensayo de YFP-GJIC fue desarrollado para su uso en el HTS.
La figura 1 ilustra los componentes y pasos del ensayo GJIC-YFP, que utiliza células de aceptador expresan una variante YFP yoduro sensibles teniendo H148Q y I152L (YFPQL) y células del donante manifestando un transportador de yoduro (SLC26A4)21 . Las dos mutaciones por YFPQL permiten el amortiguamiento de la fluorescencia por yoduro22. Se añaden yoduros aceptador Co cultivado y células de un donante; no entrar en las células del aceptador, pero son tomadas por los transportadores de SLC26A4 presente en las células del donante. Yoduro en las células del donante se difunden a través de GJs funcionamiento en células aceptor adyacente donde apaga la fluorescencia de YFPQL . Si GJs cerrados o bloqueados por inhibidores, yoduro no puede entrar en las células de aceptador para apagar de la fluorescencia. La tasa de amortiguamiento YFPQL refleja actividad GJ. El procedimiento del ensayo-YFP GJIC no es complicado ni mucho tiempo. Es compatible con HTS y puede utilizarse para probar los efectos de un gran número de compuestos en la actividad GJ en un período relativamente corto. Requiere sólo aceptador y células de donante y dos soluciones salinas equilibradas. El protocolo descrito a continuación se basa en células de LN215 cuya principales Cx es de Cx4321. El receptor LN215-YFPQL y LN215-I− células del donante se generaron por transducción con lentivirus expresando YFPQL o SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de YFP-GJIC puede utilizarse para HTS porque es robusto, rápido y barato. Un ensayo HTS es considerado robusto si el Z’-factor está por encima de 0,525. Ver Zhang et al. para una descripción del análisis estadístico utilizado para evaluar la idoneidad de HTS ensayos25. Cuando se utilizaron las células de LN215, el Z’-factor fue > 0,5 sin ninguna optimización de ensayo. Si se utilizan otros tipos de células en el ensayo y su Z’-factor es < 0.5, la robustez …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 y 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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