Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Résumé

Ici, nous fournir une description détaillée d’un montage expérimental pour une analyse de l’évaluation de l’intégrité de l’ADN dans les cellules avant la transplantation de cellules souches.

Résumé

Tige et cellules cellules souches dérivées ont un potentiel immense comme une thérapie régénératrice pour diverses maladies dégénératives. L’ADN est l’entrepôt de données génétiques dans toutes les cellules, y compris les cellules souches, et son intégrité est fondamentale pour sa capacité régénératrice. Cellules souches subissent une propagation rapide dans les laboratoires pour obtenir les numéros nécessaires à la transplantation. La croissance cellulaire accélérée conduit à la perte d’intégrité de l’ADN par des métabolites accumulés, comme réactives de l’oxygène, carbonyle et des agents alkylants. La transplantation de ces cellules se traduirait par la mauvaise prise de greffe et régénération de l’orgue de détérioration. Repiquage en outre, les cellules endommagées par ADN conduit à des mutations, l’instabilité de l’ADN, la sénescence cellulaire et éventuellement mortelles maladies comme le cancer. Par conséquent, il y a un besoin immédiat d’une méthode de contrôle de la qualité évaluer les qualités de la cellule à la transplantation. Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour l’évaluation de l’intégrité de l’ADN des cellules souches avant la transplantation de cellules.

Introduction

Les preuves expérimentales et cliniques montrent que les cellules hématopoïétiques peut améliorer modérément la performance contractile du ventricule gauche n’a pas de coeurs^{1,2,3,4,5 ,6,7,8,9}. Les progrès récents ont ouvert davantage attrayant de possibilités pour la regénération cardiovasculaire ; citons l’expression forcée des facteurs de reprogrammation de cellules....

Protocole

1. essai de comet

1. Préparation du réactif
   1. D’agarose de la bas-fondre-point, lieu 500 mg de bas point de fusion d’agarose dans 100 mL d’ADN- / eau exempte de RNA. Faire chauffer la bouteille dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose se dissout. Placer la bouteille dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
      Remarque : Pour en savoir plus, voir Azqueta et al., qui a étudié les effets de la concentration d’agarose sur le temps de déroulement d’ADN et plusieurs électrophorèse facteurs²³.
   2. Diluer le colorant SYBR green ADN dans un tampon Tris-EDTA (TE) à un rati....

Résultats

Cellules souches humaines pluripotentes induites ont été cultivés, et les dommages à l’ADN et le moment de la queue, qui ont été utilisés comme mesure d’intégrité de l’ADN, ont été analysées par le test des comètes. CSPI ont été intégrés dans l’agarose de la bas-fondre-point et placé sur une lame de verre. Les cellules ont, ensuite, traitées avec tampon de lyse, suivie par une solution alcaline, à obtenir l’ADN surenroulé. Nucléoïdes étaient grande et comètes ont été visualisées par le co.......

Discussion

Intégrité de l’ADN dépeint l’intégrité cellulaire. Cellules avec ADN endommagé sont souvent stress et finissent par perdent leur intégrité. L’intégrité des souches et de cellules de tige-cellule-dérivé étant propagés aux fins de transplantation est principale pour les cellules de remplir leur fonction désirée. La transplantation de cellules avec de l’ADN endommagé se traduirait par un taux de mauvaise prise de greffe et de la performance de la cellule^8,20. Par co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % Trypsine	Corning	25200056
Lame à 8 puits	Millicell	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	Solution de détachement cellulaire
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID : AB_2313584)
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson	Immuno Research Laboratories	711-165-152 (RRID :AB_2307443)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free,Gibco		17504-044
Matrigel growth factor reduced	Corning	354230
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
Phalloïdine A488	Technologie de la vie	A12379
Phospho-histone H2A. X (Ser139)	Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps	2577 (RRID : AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR  ; Vert I colorant gel d’acide nucléique	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher scientific	BP151-100
UltraPure Low melting point Agarose	Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Antifade