Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Summary

Ca^{2 +} indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca^{2 +} imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca^{2 +} sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Abstract

CA^{2 +} imagens de células isoladas ou tipos específicos de células dentro de tecidos intactos, muitas vezes revela padrões complexos de Ca^{2 +} sinalização. Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca^{2 +} sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer algumas informações biológicas necessárias para sinalização intracelular. De alta resolução Ca^{2 +} imagem normalmente resultados na aquisição de grandes arquivos de dados que são demorados para processo em termos de traduzir as informações de imagem em dados quantificáveis e este processo pode ser suscetível a preconceitos e erro humano. Análise de Ca^{2 +} sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de arbitrariamente selecionadas regiões de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). Esta abordagem ignora grande parte das informações de sinalização importantes contidas no FOV. Assim, a fim de maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução obtidas com Ca^{2 +}corantes ou optogenetic Ca^{2 +} análise espacial e temporal de imagens, o caso dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Os protocolos descritos neste artigo vou descrever como um alto volume de dados pode ser obtido de Ca^{2 +} imagem gravações para facilitar a mais completa análise e quantificação de Ca^{2 +} sinais gravado a partir de células usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca^{2 +} sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca^{2 +} sinalização numa população de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC), usando o GECIs especializada.

Introduction

CA^{2 +} é um mensageiro intracelular onipresente que controla uma grande variedade de processos celulares, tais como músculo contração^1,2, metabolismo³, célula proliferação^3,4, factores de ⁵, estimulação da liberação de neurotransmissores no nervo terminais^6,7e a ativação da transcrição no núcleo. ⁷ intracelular Ca^{2 +} sinais muitas vezes tomam a forma de elevações transientes em citosólico Ca^{2 +}, e estas podem ser espontâneos ou decorrentes de estimulação agonista, dependendo do tipo de célula⁸. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca^{2 +} sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer as informações biológicas necessárias para sinalização intracelular^{5, 7 , 9}. citoplasmática Ca^{2 +} sinais podem resultar do influxo de Ca^{2 +} do espaço extracelular ou via Ca^{2 +} lançamento do retículo endoplasmático (ER) através de canais de Ca^{2 +} lançamento como receptores de ryanodine (RyRs) e receptores de inositol-tri-fosfato (IP₃Rs)¹⁰. RyRs e IP₃Rs podem contribuir para a geração de sinais de Ca^{2 +} e a abertura concertada destes canais, o que combinado com vários Ca^{2 +} influxo mecanismos pode resultar em uma miríade de Ca^{2 +} padrões de sinalização que são formados pelos números e abrir a probabilidade de Ca^{2 +} influxo canais, o perfil de expressão de^{Ca 2 +} lançamento canais, a proximidade entre o influxo de Ca^{2 +} e canais de liberação e expressão e distribuição de Ca^{2 +} proteínas recaptação e extrusão. CA^{2 +} sinais podem assumir a forma de uniforme, duradouro, oscilações de alta intensidade global que pode durar vários segundos ou até minutos, propagação intracelulares e intercelulares Ca^{2 +} ondas que podem atravessar distâncias intracelulares mais de 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}, ou mais breves, espacialmente localizados eventos tais como Ca^{2 +} sparks e Ca^{2 +} sopros que ocorrem em dezenas de milissegundos prazos e espalhar a menos de 5 µm^17,18,19,20.

Microscopia fluorescente tem sido usada amplamente para monitorar Ca^{2 +} sinalização em células isoladas e cultivadas e em tecidos intactos. Tradicionalmente, estas experiências envolveram o uso de Ca^{2 +} indicadores fluorescentes, ratiometric e não-ratiometric corantes como Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre outros ^21,22,23. Estes indicadores foram projetados para ser permeável para as membranas celulares e depois ficam presos em células pela clivagem de um grupo éster via endógenas esterases. Vinculação de Ca^{2 +} para os indicadores de alta afinidade causou mudanças na fluorescência quando as células e tecidos foram iluminados pelo apropriado comprimentos de onda da luz. O uso de célula permeável Ca^{2 +} indicadores bastante reforçada a nossa compreensão de Ca^{2 +} permitido resolução espacial e quantificação destes sinais que não era possível pela análise do Ca^{2 +} sinais e sinalização em células vivas através de outros meios, tais como a eletrofisiologia. No entanto, o tradicional Ca^{2 +} indicadores têm várias limitações, tais como fotobranqueamento que ocorre ao longo de períodos de gravação estendida²⁴. Enquanto o indicador de Ca^{2 +} novo corantes tais como Cal520/590 têm sinal melhorou muito a índices de ruído e a capacidade de detectar o local Ca^{2 +} sinais²⁵, problemas com o fotobranqueamento permanecem uma preocupação para alguns investigadores ²⁶de^27,,28. Fotobranqueamento precipitado também restringe a ampliação, a taxa de aquisição de imagem, e a resolução que pode ser usada para gravações, como o aumento de potência objectivo e taxas mais elevadas de aquisição de imagem exigem aumento de intensidade de luz de excitação que aumenta o fotobranqueamento.

Estas limitações do tradicional Ca^{2 +} indicador corantes são exacerbados durante a gravação de Ca^{2 +} sinais no local, por exemplo quando gravação intracelular Ca^{2 +} sinais de tecidos intactos. Devido aos problemas acima, visualização de Ca^{2 +} sinais em situ usando célula permeável Ca^{2 +} indicadores tem sido limitada a ampliação de baixa potência e reduzidas taxas de captura de imagem, restringindo a capacidade de investigadores para gravar e quantificar o temporal ou espacialmente restrita subcellular Ca^{2 +} sinais. Assim, tem sido difícil de capturar, analisar e apreciar a complexidade espacial e temporal de Ca^{2 +} sinais, que pode ser importante na geração de respostas biológicas desejadas, conforme descrito acima. Análise de Ca^{2 +} sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de regiões selecionadas de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). A escolha arbitrária do número, tamanho e posição de ROIs, dependentes do capricho do pesquisador, severamente pode influenciar os resultados obtidos. Assim como a tendência inerente com análise ROI, esta abordagem ignora grande parte da importante sinalização informação contida o FOV, como dinâmico Ca^{2 +} eventos dentro de um arbitrariamente escolhida ROI são selecionados para análise. Além disso, a análise de ROIs falha fornecer informações sobre as características espaciais dos Ca^{2 +} sinais observados. Por exemplo, pode não ser possível distinguir entre um aumento de Ca^{2 +} resultante da propagação de uma onda de Ca^{2 +} e um altamente localizadas Ca^{2 +} liberam o evento de tabulações de Ca^{2 +} sinais dentro de um ROI.

O advento da geneticamente codificado Ca^{2 +} indicadores (GECIs) mudou radicalmente como Ca^{2 +} imagem latente pode ser realizada em situ^{29,30,31,32,33} . Existem várias vantagens em usar GECIs sobre corantes. O mais importante talvez seja que a expressão de Lino pode ser executada de maneira específica de célula, que reduz a contaminação de fundo indesejados de células não turísticos. Outra vantagem do GECIs sobre indicadores de Ca^{2 +} tradicionais é aquele fotobranqueamento é reduzido (como fluorescência e, consequentemente, fotobranqueamento só ocorre quando as células são ativas), em comparação com espécimes de corante-carregado, particularmente em alta ampliação e altas taxas de imagem capturam³⁴. Assim, imagem latente com GECIs, tais como a série GCaMP de sensores optogenetic, proporciona a investigadores a capacidade de gravar breve, localizadas sub celular Ca^{2 +} sinais em situ e investigar Ca^{2 +} sinalização em células dentro deles ambientes nativos que não tem sido possíveis anteriormente. Para maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução, análise espacial e temporal adequada dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Deve-se notar que, enquanto o GECIs podem oferecer que algumas claras vantagens, estudos recentes têm revelado que Ca^{2 +} imagem latente pode ser realizada com sucesso de grandes populações de diferentes classes neuroquímicas dos neurônios simultaneamente usando convencional CA^{2 +} indicadores que não são geneticamente codificados para o animal,³⁵. Esta abordagem usado post hoc imuno-histoquímica para revelar várias classes diferentes de neurônios disparando em alta frequência em rajadas sincronizadas e evitou o potencial que as modificações genéticas para o animal podem ter interferido com o fisiológico comportamento, o investigador procura entender^35,36.

Os protocolos descritos neste trabalho facilitam a análise mais completa e quantificação de Ca^{2 +} sinais gravado a partir de células no local usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca^{2 +} sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca^{2 +} sinalização em uma população especializada de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC). ICC são células especializadas no trato gastrointestinal (GI) que apresentam dinâmica intracelular Ca^{2 +} sinalização, como visualizado utilizando camundongos expressando GCaMPs^{37,38,39,40, 41,},⁴². Transientes de CA^{2 +} no ICC estão ligados à ativação de Ca^{2 +}-ativado Cl^– canais (codificados por Ano1) que são importantes na regulação da excitabilidade do músculo de liso intestinal células (SMCs)^{43, 44,},⁴⁵. Assim, o estudo de Ca^{2 +} sinalização em ICC é fundamental para a compreensão da motilidade intestinal. O intestino delgado murino oferece um excelente exemplo para esta demonstração, como existem duas classes de ICC que estão anatomicamente separadas e podem ser visualizadas de forma independente: eu) ICC estão localizados na área entre o músculo liso circular e longitudinal camadas, em torno do Plexo mioentérico (ICC-MY). Estas células servem como as células do marcapasso e geram a atividade elétrica conhecida como ondas lentas^46,,^47,,^48,49; II) ICC também estão localizados entre um plexo rico nos terminais dos neurônios motores (plexo muscular profunda, assim, ICC-DMP). Estas células servem como mediadores das respostas a neurotransmissão motor entérica^37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP são morfologicamente distintos e seus Ca^{2 +} sinalização comportamentos radicalmente diferem para realizar suas tarefas específicas. ICC-MY são estreladas em forma e formar uma rede de células interconectadas através de lacuna entroncamentos^51,52. CA^{2 +} sinais em ICC-MY manifesto como breves e espacialmente localizados Ca^{2 +} lançamento eventos que ocorrem em vários locais de forma assíncrona, através da rede de ICC-MY como visualizado dentro um FOV (fotografada com um objetivo X 60)³⁸. Estes sinais assíncronos são organizados temporalmente em 1 segundo de clusters que, quando juntos, tabulados, elevar-se a um líquido 1 s celular aumento de Ca^{2 +}. Estes sinais propagam de célula para célula dentro da rede da ICC e, portanto, organizam Ca^{2 +} sinalização, gerados a partir de sites sub celulares, em uma tecido grande Ca^{2 +} onda. Temporal de clustering e soma de Ca^{2 +} sinais em ICC-MY foi denominado Ca^{2 +} aglomerados transitória (CTC)³⁸. CTC ritmicamente ocorre (por exemplo, é bastante semelhantes durações e períodos semelhantes entre CTC) 30 vezes por minuto no mouse. Por outro lado, ICC-DMP são células fusiformes em forma, alguns com processos secundários, que distribuem entre SMCs e processos nervosos varizes e não independentemente formam uma rede^51,52. ICC-DMP forma junções com SMCs, no entanto e função dentro deste sincício maior, conhecido como o SIP sincício⁵³. CA^{2 +} sinais ocorrem em vários locais ao longo dos comprimentos de células, mas estes transientes não são arrastados ou temporalmente em cluster, como observado no ICC-MY³⁷. CA^{2 +} sinais no ICC-DMP ocorrem de forma estocástica, com intensidade variável, durações e características espaciais. Os protocolos abaixo, usando o exemplo do Ca^{2 +} sinalização no ICC-MY e ICC-DMP, descrever técnicas para analisar a complexa sinalização em tipos específicos de células no local. Utilizamos o sistema de p Cre-Lox inducible para expressar GCaMP6f exclusivamente no ICC, após provocar a ativação da Cre Recombinase (Cre) conduzido por um promotor específico de ICC (Kit).

Protocol

Todos os animais utilizados e os protocolos realizados neste estudo estão de acordo com os institutos nacionais de guia da saúde para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidados na Universidade de Nevada, Reno e uso institucional do Animal. 1. geração de ratos KitGCaMP6f Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f ratos) e c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre ratos) para gerar o ICC específicos GCaMP6f expressando animais…

Representative Results

Usando ratos Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinâmica Ca2 + sinalização de comportamentos de ICC no trato gastrointestinal podem ser fotografados no local. Com microscopia confocal, imagens de alta resolução de populações específicas de ICC podem ser adquiridas sem contaminar os sinais de outras populações de ICC dentro do mesmo tecido mas em planos anatomicamente distintos do foco (Figura 2A)37…

Discussion

CA^{2 +} imagem de tipos específicos de células em tecidos intactos ou dentro de redes de células, muitas vezes revela padrões complexos de transientes de Ca^{2 +} . Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes e cinética destes eventos. STM e análise PTCL fornecem uma oportunidade para maximizar a quantidade de dados quantitativos, resultantes das gravações deste tipo.

<p class="jove_content…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6