Une série de méthodes d’immobilisation a été créée pour permettre l’irradiation ciblée des vivants Caenorhabditis elegans individus utilisant un microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-thin récemment développés puce avec rétention d’eau. Cette nouvelle immobilisation sur puce est aussi convenable pour l’imagerie des observations. Le traitement détaillé et exemples d’application de la puce sont expliqués.
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Article de méthode
Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau
Dans cet article
Résumé
Résumé
Rayonnement est employé couramment pour des applications biologiques et pour l’élevage de faisceau d’ions, et parmi ces méthodes, l’irradiation microfaisceaux représente un puissant moyen d’identifier les sites sensible dans les organismes vivants. Cet article décrit une série de méthodes d’immobilisation sur puce développées pour l’irradiation de microfaisceaux ciblé des individus vivants de Caenorhabditis elegans. Notamment, le traitement des puces microfluidiques polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous avons développés précédemment pour immobiliser c. elegans individus sans avoir besoin d’anesthésie est expliquée en détail. Cette puce, dénommée une feuille de ver, est résiliente pour permettre les canaux microfluidiques à décompresser, et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n'est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux. En outre, la feuille de ver montre la rétention d’eau et permet aux individus de c. elegans de faire l’objet d’une observation microscopique pendant de longues périodes dans des conditions live. En outre, la feuille est seulement 300 µm d’épaisseur, ce qui permet des ions lourds tels que les ions de carbone pour passer à travers la feuille renfermant les animaux, permettant ainsi à détecter les particules d’ion et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. Parce que les films de couverture utilisé pour enfermant les animaux est très importante pour l’immobilisation à long terme avec succès, nous avons procédé la sélection des films adaptés de la couverture et a montré un recommandée chez certains films. Comme un exemple d’application de la puce, nous avons introduit l’observation d’imagerie des activités musculaires des animaux entourant le canal microfluidique de la feuille de ver, ainsi que l’irradiation de microfaisceaux. Ces exemples indiquent que les feuilles de ver ont considérablement élargi les possibilités d’expériences biologiques.
Introduction
Rayonnement, y compris les rayons x, rayons gamma et faisceau d’ions lourds, est employé couramment pour des applications biologiques telles que dans le diagnostic du cancer et le traitement et à la reproduction de faisceau d’ions. Nombreuses études et développements techniques se concentrent actuellement sur les effets des radiations1,2,3. Irradiation par Microfaisceaux est un moyen efficace d’identifier les sites sensible dans la vie des organismes4. Takasaki Advanced rayonnement recherche Institut des instituts nationaux pour Quantum et radiologique....
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Protocole
1. les souches et l’entretien
- Sélectionnez une souche adaptée de c. elegans et Escherichia coli (nourriture) selon le but de l’expérience.
Remarque : Dans le présent document, sauvage N210c. elegans (Figure 2A) est utilisé généralement et HBR4 :goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 est seulement employé pour test d’imagerie. E. coli OP50 a été utilisé comme nourriture pour le c. elegans. Certains mutants avec la forme du corps anormaux, tels que le mutant unc-119(e2498) III avec....
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Résultats
Active c. elegans individus pourraient être immobilisés avec succès en utilisant un PDMS ultra-mince, mouillable, puce microfluidique (feuille de ver). Nous avons étudié la pertinence des films de couverture différente pour l’étanchéité de la feuille de ver, comme décrit dans le protocole 3 de l’article. Pour évaluer les effets d’étanchéité des films de la couverture, nous avons déterminé la motilité des animaux 3 h après immobilisation sur puce en utilisant le couvercle en verre.......
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Discussion
Immobilisation sur puce de c. elegans dans des conditions live à l’aide d’une puce de microfluidique PDMS mouillable permet l’irradiation microfaisceaux ciblée efficace de plusieurs animaux. La facilité de manutention et de fonctionnalités pour éviter le dessèchement font de ce système pour des applications non seulement dans l’irradiation des microfaisceaux, mais aussi dans plusieurs essais comportements. Ces feuilles de ver ont déjà été commercialisés et peuvent être facilement obtenus. Puces microfluidique cl.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Dr Atsushi Higashitani pour aimables conseils concernant le traitement de c. elegans et DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota et Yasuhiko Kobayashi pour discussions précieuses. Les auteurs tiennent à remercier le centre phytogénétique Caenorhabditis pour la fourniture de souches de c. elegans et e. coli. Nous remercions l’équipe du cyclotron de TIARA à Takasaki-TVQ pour leur aimable collaboration avec les expériences d’irradiation. Nous remercions le Dr Susan Furness pour l’édition d’un projet de ce manuscrit. Cette étude a été financée en partie par KAKENHI (Grant numéros JP15K11921 et JP18K18839) de la JSPS à M.S.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C. elegans souche de type sauvage | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis | N2 | de type sauvage C. elegans souche généralement utilisée dans cette étude |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutante souche | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis | CB4845 | C. elegans utilisée uniquement comme exemple de mutants avec une forme corporelle anormale ; |
| C. elegans HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis | HBR4 | Le génotype de cette souche transgénique C. elegans est HBR4 :goeIs3[pmyo-3 ::GCamP3.35 :: unc-54&ndash ; 3' utr, unc-119(+)]V. Cette souche n’a été utilisée que pour l’observation par imagerie. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis | OP50 | E. coli souche utilisée comme aliment pour C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japon | BCM17-0001 | Puce microfluidique avec 25 50/60-µ droites ; m canaux de largeur utilisés dans toutes les expériences et observations de cet article ; |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japon | BCM18-0001 | Puce microfluidique avec 20 60 droites µ ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les adultes 3 à 5 jours après l’éclosion à 20 °C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japon | BCM18-0002 | Puce microfluidique avec 20 50 µ droits ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les jeunes adultes ~3 jours après l’éclosion à 20° ;C. ; |
| VERRE MICRO COVER | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Verre de couverture (épaisseur : 130-170 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japon | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Articles groupés de feuilles de vers. PS filim (épaisseur : ~130 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3. |
| Film polyester Lumirror TORAY | INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japon | Lumirror T60 (t 125 & micro ; m) | PET filim (épaisseur : 125 µ ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3 |
| IWAKI 60 mm/parabole non traitée | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon). | 1010-060 | Antenne non traitée utilisée pour l’induction de C. elegans dans le Protocole 1 |
| IWAKI 35 mm/antenne non traitée | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon). | 1010-035 | Antenne non traitée utilisée dans les essais de locomotion dans le protocole 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Eau ultrapure | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japon | 62020 | 120 mm x 215 mm ; 200 feuilles/ boîte |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker spécialisé pour la prise C. elegans |
| Système de stéréomicroscope de recherche | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | Micriscope SZX16 | utilisé dans toutes les expériences et observations dans cet article |
| Support de mise au point motorisé pour SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | SZX2-ILLB | Il a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le protocole 3-8. |
| Objectif Lentille (& fois ; 1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | SDFPLAPO1× ; PF | NA : 0,15 ; L.D. : 60 mm. Ce prêt a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le Protocole 3-8. |
| Objectif Lentille (& fois ; 2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | SDFPLAPO2XPFC | NA : 0,3 ; L.D. : 20 mm. Ce ; Lends a été utilisé pour l’imagerie des observations. |
| Source lumineuse au mercure | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | U-LH100HG | Le large spectre d’émission permet de mener une gamme d’expériences d’imagerie de fluorescence en utilisant tous les fluorophores courants. |
| Unité de filtre fluorescent SZX16 (haute performance pour YFP) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon | SZX2-FYFPHQ | Ex : 490-500 nm ; Em : 510 à 560. Cela a été utilisé pour l’observation par imagerie de la souche HBR4. |
| Appareil photo numérique haute vitesse EXILIM | CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japon | EX-F1 Les figures 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C et la vidéo 1 ont été obtenues à l’aide de cet appareil photo numérique. | |
| Office 2013 | Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, États-Unis Logiciel | Excel utilisé pour les analyses statistiques |
Références
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y.
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Réimpressions et autorisations
