यहां, हम एक बीएसएल-2 उच्च रोगजनक वायरस मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन को शामिल करने की स्थापना में स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इन कूटलिखित कणों एक luciferase रिपोर्टर जीन लक्ष्य मेजबान कोशिकाओं में वायरस प्रविष्टि के परिमाणन की अनुमति होते हैं ।
प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से उपलब्ध hek-293t सेल लाइन के एक सरल अभिकर्मक प्रक्रिया का उपयोग कर, एक murine ल्यूकेमिया वायरस (mlv) कोर और luciferase रिपोर्टर के साथ कोरोनावायरस (cov) स्पाइक (एस) फ्यूजन प्रोटीन स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए करना है । एक बार का गठन किया और निर्माता कोशिकाओं से जारी, इन स्यूडोविरिओन एक luciferase रिपोर्टर जीन शामिल. चूँकि वे केवल उनकी सतह पर विषमजातीय कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन होते हैं, अतः कणों के प्रवेश चरणों के लिए उनके देशी कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं. इस तरह के रूप में, वे मेजबान कोशिकाओं में वायरल प्रवेश का अध्ययन करने के लिए देशी virions के उत्कृष्ट surrogates हैं । लक्ष्य कोशिकाओं में सफल प्रवेश और संक्रमण पर, luciferase रिपोर्टर मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है और व्यक्त की है । एक साधारण luciferase परख का उपयोग करना, transduced कोशिकाओं को आसानी से quantified जा सकता है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस तरह के मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस (MERS-cov) के रूप में उच्च रोगजनक कोरोनावायरसों के साथ काम के लिए आवश्यक सुविधाएं बीएसएल-3 सुविधाओं के बजाय जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) सुविधाओं में किया जा सकता है और गंभीर एक्यूट श्वसन सिंड्रोम कोरोनाविरस (सार्स-सीओवी) । एक और लाभ अपनी बहुमुखी प्रतिभा से आता है के रूप में यह लिफाफा प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों से संबंधित, इस तरह के वर्ग के रूप में मैं इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा) और ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी), वर्ग द्वितीय सेमलीकी वन वायरस E1 प्रोटीन, या कक्षा III vesicular स्टेमाइटिस वायरस जी ग्लाइकोप्रोटीन । कार्यप्रणाली की एक सीमा यह है कि यह केवल वायरस प्रविष्टि लिफाफा प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता कदम पुनर्निमित कर सकते है जांच की जा रही है । अन्य वायरल जीवन चक्र चरणों का अध्ययन करने के लिए, अन्य तरीकों की आवश्यकता है । कई अनुप्रयोगों के उदाहरण इन छद्म प्रकार कणों में इस्तेमाल किया जा सकता है मेजबान सेल संवेदनशीलता और अनुवर्तन की जांच शामिल है और वायरस प्रवेश inhibitors के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए वायरल प्रवेश रास्ते काटना इस्तेमाल किया ।
मेजबान सेल प्रविष्टि वायरल संक्रामक जीवन चक्र के प्रारंभिक कदम का गठन किया । आवरण वायरस के लिए, यह एक एकल मेजबान सेल रिसेप्टर या कई रिसेप्टर्स, वायरल और सेलुलर झिल्ली के विलय के बाद के लिए बाध्यकारी शामिल है । ये आवश्यक कार्य वायरल लिफाफे द्वारा किए जाते हैं नच१,२. कोरोनाविरस लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन स्पाइक (एस) प्रोटीन कहा जाता है और वर्ग मैं वायरल फ्यूजन प्रोटीन2,3,4,5,6का एक सदस्य है । वायरल लिफाफा नच का अध्ययन एक दिया वायरस के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि: जीवन चक्र दीक्षा, अपने मेजबान और सेलुलर अनुवर्तन, interspecies संचरण, वायरल रोगजनन, साथ ही मेजबान सेल प्रविष्टि रास्ते. वायरल कूटलिखित कणों, भी कूटविरिओन नाम, शक्तिशाली उपकरण है कि हमें आसानी से वायरल फ्यूजन प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए सक्षम हैं । स्यूडोटाइप कणों या स्यूडोविरिओन चिएरिक विरिओन होते हैं जो उनकी सतह पर एक विषमजातीय वायरल लिफाफा प्रोटीन के साथ एक सरोगेट वायरल कोर से मिलकर बनता है । प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कोरोनेविरस स्पाइक स्यूडोटाइप कणों को प्राप्त करने का तरीका है जो कि एक मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) कोर पर आधारित है और इसमें एक ल्यूसीफ्रैज़ रिपोर्टर जीन शामिल हैं । उदाहरण के रूप में, उच्च रोगजनक गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (एसएआरएस) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS) कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन के साथ स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन करने की विधि प्रस्तुत की गई है । प्रोटोकॉल में शामिल अभिकर्मक प्रक्रिया का वर्णन, कैसे अतिसंवेदनशील लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, और लूसिफेट्रेस परख द्वारा संक्रमणशीलता परिमाणन.
चूंकि स्यूडोविरिओन के प्रवेश चरणों को उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस द्वारा नियंत्रित किया जाता है, वे एक समान फैशन में देशी समकक्षों के लिए कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं । इस प्रकार, वे कार्यात्मक संक्रामकता के उत्कृष्ट सरोगेट हैं । कूटलिखित कणों आम तौर पर रेट्रोवायरस जैसे पैतृक मॉडल वायरस से व्युत्पंन कर रहे है (mlv7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 और लेंटीवायरस मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस — एचआईवी23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , ३२ , ३३ , ३४ , ३५) या रैब्डोवाइरस (vesicular स्टेमाइटिस वायरस-vsv३६,३९,४०,४१,४२,४३,४४ , ४५ , ४६ , ४७). जब कूटलेखन में प्रयोग किया जाता है, पैतृक वायरस ‘ जीनोम आवश्यक जीन को हटाने के लिए संशोधित कर रहे हैं, उंहें एक पूर्ण प्रतिकृति चक्र पूरा करने के लिए दोषपूर्ण प्रतिपादन । यह सुविधा उन्हें मध्यवर्ती जैव सुरक्षा स्तर की सुविधाओं (बीएसएल-2) में इस्तेमाल करने की अनुमति देती है और अत्यधिक रोगजनक देशी विषाणुओं का उपयोग करने पर एक महत्वपूर्ण लाभ है जो उच्च जैव सुरक्षा सुविधाओं (बीएसएल-3, बीएसएल-4 की आवश्यकता होती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं) जब वायरस प्रवेश अध्ययन का आयोजन । यहां, एस प्रोटीन के जोखिम समूह 3 रोगजनकों सार्स-cov और mers-cov वायरल लिफाफा प्रोटीन के उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है mlv स्यूडोटाइप कणों में शामिल, सार्स सृजन एस और MERS-cov एस स्यूडोविरियंस (sars-spp और mers-spp, क्रमशः) । इन स्यूडोविरियनों को सफलतापूर्वक इन वायरस४८,४९,५०,५१के प्रवेश की घटनाओं पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । एक और लाभ यह है कि तकनीक यहां वर्णित है कि कोरोनावायरस एस प्रोटीन कूटलेखन करने के लिए सीमित नहीं है: यह बहुत लचीला है और वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों के प्रतिनिधियों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरणों में इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा, कक्षा मैं)५२, ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी कक्षा मैं), alphavirus सेमलीकी वन वायरस के E1 प्रोटीन (sfv, द्वितीय श्रेणी), और vsv ग्लाइकोप्रोटीन (जी, कक्षा III)५३शामिल हैं । इसके अलावा, एक से अधिक प्रकार के वायरल ग्लाइकोप्रोटीन को एक स्यूडोटाइप कण में सह-शामिल किया जा सकता है, जैसा कि इंफ्लूएंजा हा-और एनए-स्यूडोटाइप कणों५१के मामले में होता है ।
bartosch एट अल.20द्वारा प्रदर्शन किया काम के आधार पर, इस प्रोटोकॉल एक तीन plasmid सह-transfection व्यापक रूप से उपलब्ध है और अत्यधिक transfection-सक्षम हेक-293t सेल लाइन का उपयोग कर रणनीति के साथ mlv pseudotyped कणों की पीढ़ी का वर्णन ५४. पहले प्लाज्मिड mlv कोर जीन गैग और पीओएल encodes लेकिन mlv लिफाफा encodes जीन का अभाव है । दूसरा प्लाज्मिड एक स्थानांतरण सदिश है कि एक जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन encodes, एक mlv Ψ-आरएनए पैकेजिंग संकेत, साथ 5 ‘-और 3 ‘-flanking mlv लांग टर्मिनल दोहराने (ltr) क्षेत्रों । तीसरे प्लाज्मिड ब्याज के फ्यूजन प्रोटीन encodes, इस मामले में या तो सार्स-cov एस या MERS-cov एस प्रोटीन. तीन plasmids का एक अभिकर्मक अभिकर्मक, वायरल आरएनए और प्रोटीन का उपयोग करने के सह-अभिकर्मक पर पारफेक्टेड कणों के उत्पादन की अनुमति कोशिकाओं के भीतर व्यक्त हो । चूंकि mlv स्यूडोविरिओन रीढ़ के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह प्लाज्मा झिल्ली पर होता है: luciferase जीन रिपोर्टर और पैकेजिंग सिग्नल युक्त rnas नवजात कणों में समझाया जाता है जो प्लाज्मा झिल्ली को भी शामिल करते हैं-व्यक्त कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन. कणों कि कोशिकाओं से बाहर कली उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस प्रोटीन होते हैं और संक्रामकता assays में उपयोग के लिए काटा जाता है । क्योंकि कूटलिखित कणों को कोरोनाविरस एस प्रोटीन बंदरगाह और नहीं mlv लिफाफा प्रोटीन, कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया, वे प्रवेश कदम के लिए अपने मूल कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं । वायरल आरएनए लूसिफेरेज़ रिपोर्टर और अगल बगल लटर्स युक्त तो सेल के भीतर जारी किया है और रेट्रोवाइरल पॉलीमरेज़ गतिविधियों के डीएनए और मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण में अपने रिवर्स प्रतिलेखन सक्षम । संक्रमित कोशिकाओं में वायरल स्यूडोटाइप कणों की संक्रामकता का quantification तो एक सरल luciferase गतिविधि परख के साथ प्रदर्शन किया है । क्योंकि डीएनए अनुक्रम है कि मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है केवल luciferase जीन और mlv या कोरोनाविरस प्रोटीन-एंकोडिंग जीन में से कोई भी शामिल है, वे स्वाभाविक प्रतिकृति से उपयोग करने के लिए सुरक्षित है-सक्षम देशी वायरस ।
सुरक्षित surrogates और उच्च लिफाफे के विभिंन प्रकार के निगमन की अनुमति के लिए अनुकूलनीय होने के अलावा नच, छद्म यहां वर्णित कणों भी अत्यधिक बहुमुखी है और वायरस प्रविष्टि के कई पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है । यह शामिल है, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं है: वायरस के संक्रमण के लिए मेजबान सेल संवेदनशीलता का परीक्षण, सेलुलर प्रवेश रास्ते का विश्लेषण एक घिरा वायरस का उपयोग करता है, औषधीय inhibitors और दवा स्क्रीनिंग के प्रभाव का अध्ययन, बेअसर एंटीबॉडी का आयोजन assays, आवरण वायरस है कि सभ्य नहीं किया जा सकता है, और जीन वितरण, ब्याज के जीन की स्थिर सेलुलर अभिव्यक्ति, या जीन silencing के लिए वायरल वैक्टर पैदा की विशेषता मेजबान सेल प्रविष्टि ।
यह प्रोटोकॉल एक बीएसएल-2 की स्थापना में जोखिम समूह 3 कोरोनावायरस, एसएआरएस-सीओवी और मर्स-सीओवी के एस प्रोटीन के असर वाले स्यूडोटाइप कणों को कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इन कणों, जो एक luciferase रिपोर्टर जीन को शामिल, हमें आसानी से एक अपेक्षाकृत सरल luciferase परख४८,४९,५०,५१द्वारा कोरोनाविरस एस-मध्यस्थता प्रविष्टि घटनाओं यों तो करने के लिए सक्षम. संक्रामकता में स्वतंत्र कोशिकाओं का उपयोग कर, हम पुष्टि करते है कि luciferase गतिविधि मापा कणों की एकाग्रता पर निर्भर है । इसके अलावा, ACE2 और DPP4 रिसेप्टर अभिकर्मक खराब स्वतंत्र कक्ष लाइनों में अधिक कुशल प्रवेश के लिए अनुमति देता है, जैसे hek-293t कोशिकाओं । विधि अत्यधिक अन्य वायरल लिफाफा नच के लिए अनुकूलनीय है और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है४८,४९,५०,५१,५२,५३, ५५,५६,५७,५८,५९, अक्सर जैव रासायनिक विश्लेषण या देशी वायरस के संक्रमण की तरह अन्य assays के पूरक करने के लिए.
प्रोटोकॉल हम यहां का वर्णन retrovirus mlv कि एक luciferase रिपोर्टर शामिल पर आधारित है । हालांकि, यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि अन्य स्यूडोटाइपिंग प्रणालियों की एक बहुत व्यापक सरणी है जिसे सफलतापूर्वक पैकेजिंग के लिए विकसित किया गया है कोरोनाविरस एस12,13,25,26, 30 , 31 , ३२ और अन्य वायरल लिफाफा नच10,11,14,16,17,23,24, 29 , ३३ , ३८ , ४० , ४२ , ४४ , ४६. इनमें से कुछ अन्य प्रणालियाँ सामान्यतः प्रयुक्त एमएलवी रेट्रोवायरल कोर7,8,9,10,11,12,13 पर आधारित हैं ,14,15,16,17,18,19,20, या व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली मसूर की दाल पर आधारित एचआईवी-1 छद्म टंकण प्रणाली विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करते हुए23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,३२,३३,३४,३५, या के साथ रैब्डोवायरस vesicular स्टेमाइटिस वायरस (vsv) कोर के रूप में, जो एक विस्तृत विविधता को शामिल करने की अनुमति देता है लिफाफा नच के, और फिर से कार्यरत विभिन्न रणनीतियों के साथ३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३ ,४४,४५,४६,४७. इसके अलावा, अन्य रिपोर्टर्स जैसे कि जीएफपी11,13 और आरएफपी३६जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या β-galactosidase16,17 और स्रावित की तरह luciferase के अलावा अन्य एंजाइमों क्षारीय फॉस्फोटेज (सीएपी)४२ सफलतापूर्वक मापन के लिए नियोजित किया गया है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परख में, एक क्षणिक अभिकर्मक mlv और cov एस जीन और प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, अभिव्यक्ति के लिए अन्य रणनीतियां हैं, जैसे स्यूडोटाइप वायरस के उत्पादन के लिए स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी7,14। इन प्रणालियों में से प्रत्येक के रूप में अपने फायदे और नुकसान है, यह निर्णय लेने के लिए महत्वपूर्ण है, जब तय है जो प्रणाली सबसे अच्छा सूट एक जांचकर्ता की जरूरत है स्यूडोविरिओन कोर (mlv, एचआईवी-1, vsv या दूसरों), कैसे फैसला करने के लिए निंनलिखित महत्वपूर्ण मापदंडों चयनात्मक एक विशेष छद्म टंकण कोर एक विशिष्ट वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, परख readout के लिए रिपोर्टर को शामिल करने में है (gfp, luciferase, seap या अन्य), और अभिकर्मक रणनीति (सह में शामिल plasmids की संख्या-अभिकर्मक, क्षणिक अभिकर्मक या स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी).
इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो जोर देने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सेल घनत्व, विशेष रूप से हेक-293t/17 उत्पादक सेल लाइन सफल ट्रांसफेक्शन सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । 40 की सीमा में एक सेल घनत्व-60% कन्फ्लुएंसी इष्टतम होना पाया गया । उच्च घनत्व आम तौर पर कम अभिकर्मक क्षमता और कम कण उत्पादन में परिणाम. इसके अलावा, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि हेक-293t/17 कोशिकाएं अन्य सेल लाइनों की तुलना में कम आसंन हैं । उन्हें अनावश्यक रूप से अलग करने से बचने के लिए देखभाल का प्रयोग करना चाहिए । एक विकल्प के पालन को बढ़ाने के लिए पाली-डी-lysine के साथ सेल संस्कृति प्लास्टिक सतहों का इलाज है । इसके अलावा, उच्च सेल मार्ग अक्सर गरीब ट्रांसफेक्शन दरों में परिणाम है । हेक-293t/17 कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक जोड़ने के बाद, यह भी याद रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिका पारगम्यता बढ़ जाती है । यही कारण है कि इस बिंदु पर यह सबसे अच्छा है के रूप में वे cytotoxicity वृद्धि हो सकती है एंटीबायोटिक दवाओं युक्त माध्यम का उपयोग कर से बचने के लिए । स्यूडोटाइप कणों को एकत्र करने से पहले, ट्रांसफेक्टेड हेक-293t/17 सेल सुपरनैटेंट के रंग की जांच करें । आम तौर पर, transfection के ४८ ज के बाद, सेल संस्कृति मध्यम रंग एक नारंगी गुलाबी टिंगल लेता है । पीले रंग का मध्यम आम तौर पर गरीब छद्म कणों पैदावार के लिए अनुवाद और अक्सर सेल बोने घनत्व या उच्च मार्ग संख्या के साथ मुद्दों का एक परिणाम है ।
इस प्रोटोकॉल में, स्यूडोटाइप कण उत्पादन 6-वेल प्लेट प्रारूप में किया जाता है । उत्पादित कणों की मात्रा बढ़ाने के लिए, एक 6-वेल प्लेट के कई कुओं को एक ही plasmids मिश्रण के साथ transfected किया जा सकता है और supernatants एक साथ परित किया जा सकता है । पूल तो स्पष्ट किया जा सकता है, फ़िल्टर्ड और aliquoted । वैकल्पिक रूप से, उत्पादन पैमाने पर करने के लिए, जहाजों के अन्य प्रकार (जैसे, 25, या ७५ सेमी2 flasks) इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, ट्रांसफेक्शन शर्तों को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में, संक्रामकता परख एक 24-अच्छी तरह से थाली प्रारूप और एक luminometer है कि केवल माप एक समय में एक ट्यूब की अनुमति देता है का उपयोग किया जाता है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए, अंय प्रारूपों भी इस तरह के रूप में संभव है ९६-well प्लेट प्रारूप और एक थाली रीडर luminometer । ल्यूसीफेरेज परख के लिए वॉल्यूम और अभिकर्मकों को तदनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता है । cryovials में स्यूडोटाइप कणों का भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस संक्रामकता में उल्लेखनीय कमी के बिना कई महीनों के लिए अपनी स्थिरता बनाए रखता है । यह उनके विषय के लिए उन्हें फ्रीज-गल चक्र के रूप में यह समय के साथ उनके संक्रामकता में कमी होगी अनुशंसित नहीं है. इस प्रकार, यह उन्हें एक संक्रमण से पहले इस तरह के 0.5-1 मिलीलीटर और गल के रूप में छोटे aliquots में स्टोर करने के लिए सबसे अच्छा है ।
यहां प्रस्तुत विधि में कई सीमाएं हैं । एक महत्वपूर्ण तथ्य यह है कि छद्म टाइप कणों केवल वायरल प्रवेश घटनाओं को फिर से दोहराती है । संक्रामक जीवन चक्र में अन्य चरणों का विश्लेषण करने के लिए, अन्य assays आवश्यक हैं । इसके अलावा, प्लाज्मा झिल्ली पर mlv कणों कली के रूप में, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन का अध्ययन किया जा रहा उत्पादन के दौरान स्यूडोविरिओन में समावेश के लिए प्लाज्मा झिल्ली के लिए भी यातायात की जरूरत है. इस तरह के रूप में, यह जानना महत्वपूर्ण है जहां कोशिका में एक विशेष वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के साथ subcellular स्थानीयकरण visualizing द्वारा जैसे अभिकर्मक शर्तों में व्यक्त की है, और/ प्रोटीन । इसके अलावा, जबकि प्रोटोकॉल का वर्णन चरणों का उत्पादन और संक्रामकता परीक्षण करने के लिए, यह विस्तार से नहीं है कैसे को मापने के लिए वायरल लिफाफा आभासी छद्म में ग्लाइक । एक विधि कणों के केंद्रित समाधान पर पश्चिमी ब्लॉट assays प्रदर्शन करने के लिए है, के रूप में पहले वर्णित५०,५१ के लिए MERS-cov एस निगमन. इन assays में, s लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के MERS-cov कैप्सिड के साथ जांच की है (p30) mlv का प्रोटीन, जो हमें कणों में एस प्रोटीन के निगमन सामान्य करने की अनुमति. ऐसे assays के अंय उदाहरण का विश्लेषण वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन शामिल करने के लिए स्यूडोविरिओन में सार्स-सीओवी एस निगमन के लिए एक एचआईवी-1 लेंटीवायरल स्यूडोविरिओन सिस्टम३२ , इबोला ग्लाइरोप्रोटीन (जीपी) एक और एमएलवी स्यूडोटाइप में किया गया है । कण प्रणाली17, और इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (हा) और neuraminidase (एनए) में vsv स्यूडोविरिन्स३८. स्यूडोटाइप कण उत्पादन की विशेषता में हाल ही में एक विकास अभिनव इमेजिंग उपकरणों जैसे nanosight का उपयोग है: यह हमें सीधे कल्पना, मात्रात्मक, और आकार वायरल कणों५०के लिए सक्षम बनाता है । डिवाइस समग्र कण उत्पादन पर विस्तृत जानकारी प्रदान करता है; हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि यह लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन निगमन पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । इन बहुमुखी स्यूडोविरिओन कणों के आवेदन के लिए एक भविष्य की दिशा व्यक्तिगत वायरल फ्यूजन एकल कण ट्रैकिंग का उपयोग कर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए है, microfluidics और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी६०,६१ ,६२. इस तरह के दृष्टिकोणों को इंफ्लूएंजा वायरस और डियर कोरोनाविरस कणों के साथ-साथ इंफ्लूएंजा हा-और एनए-स्यूडोटाइप vsv आधारित स्यूडोविरिन्स६३पर सफलतापूर्वक लागू किया गया । वर्तमान में कोरोनाविरस एस-स्यूडोटाइप एमएलवी आधारित कणों के लिए लागू की गई ऐसी तकनीकों की तैनाती विकसित की जा रही है ।
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी टिप्पणियों के लिए whittaker और डैनियल लैब्स के सभी सदस्यों को धंयवाद देना चाहता हूं । अनुसंधान धन nih अनुदान R21 AI111085 और R01 AI135270 द्वारा प्रदान किया गया था । टीटी अनुदान सं के तहत cornell विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम में राष्ट्रपति जीवन विज्ञान फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. l.n. अनुदान सं के तहत एक शमूएल सी फ्लेमिंग परिवार स्नातक फैलोशिप और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन १५०४८४६ (S.D. और g.r.w.) द्वारा भी समर्थित है ।
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African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells | ATCC | CRL-1586 | |
Human hepatic Huh-7 cells | Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | JCRB0403 | |
Inverted light microscope with 10 × objective | Nikon | TS100 | |
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate | Corning Mediatech | 10-017-CV | |
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 1614071 | |
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES) | Corning Mediatech | 25-060-Cl | |
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution | Corning Mediatech | 30-002-Cl | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning Mediatech | 21-030-CV | |
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution | Corning Mediatech | 25-053-Cl | |
Cell counting slides with grids | Kova | 87144 | |
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 11668-027 | |
0.45 µm pore-size sterile filter | Pall | 4184 | |
10 mL syringes | BD | 309604 | |
5 × luciferase assay lysis buffer | Promega | E1531 | |
Luciferin, substrate for luciferase assay | Promega | E1501 | |
Sterile water | VWR | E476-1L | |
GloMax 20/20 luminometer | Promega | 2030-100 |