Humant Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G påvisning af celle-baseret analyse

Summary

Celle-baserede assay er en meget udbredt metode til at påvise serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Denne metode kan anvendes til klinisk diagnose og videnskabelige undersøgelser af neuromyelitis optisk spektrum forstyrrelser.

Abstract

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) er den kerne diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum forstyrrelser (NMOSD). Celle-baserede analysen (CBA) er en meget anvendt metode til at opdage anti-AQP4 IgG i humant serum med høj følsomhed og specificitet. Kort, serum anti-AQP4 IgG er fanget af AQP4-transfekteret celle, der er fastsat på biochip derefter fundet af en fluorescein-mærket sekundær antistof. Fluorescens mikroskopi er udnyttet til at visualisere fluorescens, og intensiteten af Fluorescens er evalueret af mindst to erfarne klinikere. En endelig diagnose af NMOSD kan gøres baseret på en kombination af anti-AQP4 IgG påvisning resultater, kliniske manifestationer og neuroradiological resultater. Ifølge tidligere undersøgelser, CBA er mere følsom og specifik end andre anti-AQP4 IgG påvisningsmetoder, og det kan anvendes til både klinisk diagnose og undersøgelser af NMOSD. Metoden har begrænsninger; for eksempel, mangler en international skala til at evaluere serum anti-AQP4 IgG titers stadig. Her, er en detaljeret protokol for humant serum anti-AQP4 IgG påvisning ved hjælp af CBA beskrevet.

Introduction

Serum AQP4 IgG er en core diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum forstyrrelser (NMOSD)¹. Celle-baserede analysen (CBA) er en udbredt anti-AQP4 IgG påvisningsmetode med høj følsomhed og specificitet. Her, er en detaljeret protokol for CBA indført.

AQP4, en vand kanal protein, har seks membran-spænder enheder og to spiralformet domæner omkring en vandig pore². Anti-AQP4 IgG er involveret i patogenesen af NMOSD gennem binding til sit mål AQP4, som er hovedsageligt placeret på endfeet af astrocytter³. Det har vist sig at anti-AQP4 IgG er positiv i cirka to tredjedele af NMOSD patienter⁴. I de seneste internationale diagnostiske kriterier for NMOSD, er anti-AQP4 IgG betragtes som et grundlæggende diagnostisk biomarkør⁵. I denne forbindelse, det er afgørende at etablere en pålidelig protokol for at opdage humant serum anti-AQP4 IgG og lette kliniske diagnose af NMOSD.

I øjeblikket er forskellige anti-AQP4 IgG påvisningsmetoderne tilgængelige, såsom CBA, væv-baserede assay, enzym-forbundet immunosorbent assay og flow flowcytometri^6,7. CBA beskæftiger EU90 celler, som er transfekteret med menneskelige AQP4, til at fange anti-AQP4 IgG. Erobrede anti-AQP4 IgG er opdaget af fluorescerende sekundære antistoffer og efterfølgende visualiseret ved mikroskopi. Akkumulere beviser har vist, at CBA er mere følsom og specifik end andre anti-AQP4 IgG påvisning metoder^6,7. Ifølge en meta-analyse, følsomhed og specificitet af CBA viste sig at være 76% og 99%, hvilket var højere end væv-baserede og enzym-forbundet immunosorbent undersøgelser vedrørende⁶. Derudover blev en multicenter sammenligning af diagnostiske assays af anti-AQP4 IgG gennemført⁷. Ialt 193 undersøgelse emner fra 15 europæiske diagnostiske Centre var tilmeldt⁷. Fire forskellige metoder blev udnyttet til at opdage serum anti-AQP4 IgG⁷. Det blev påvist, at CBA var mere følsom og specifik end andre metoder⁷. Som AQP4 er udtrykt som to store isoformer (AQP4-M1 og AQP4-M23), transfekteret anti-AQP4 IgG fange celle med enten AQP4-M1 eller AQP4-M23. Hvilken type af fange celle er imidlertid bedre resterne kontroversielle. En undersøgelse har støttet AQP4-M1 baseret CBA⁸, mens andre har anført, at AQP4-M23 baseret CBA er bedre^7,9,10. Dog kan AQP4-M23-baserede CBA give falsk positive resultater på grund af uspecifik IgG bindende⁸. Jarius al.. ¹¹ rapporterede, at der var ingen signifikant forskel i anti-AQP4 IgG opdagelse takster mellem AQP4-M1 og AQP4-M23-baseret CBAs.

I sammendrag, serum anti-AQP4 IgG er en core biomarkør for NMOSD. CBA har højere specificitet og sensitivitet end andre anti-AQP4 IgG detektionsmetoder. Det er fortsat kontroversielt, om AQP4-M1 – eller AQP4-M23-baserede CBA er bedre. I denne artikel, er en detaljeret protokol for AQP4-M1-baserede CBA beskrevet, som kan anvendes til klinisk diagnose og undersøgelser af NMOSD.

Protocol

Denne procedure blev vedtaget af den etiske komité i det første Hospital i Jilin Universitet og blev udført på cirka 1.500 emner. 1. patienten tilmelding og blod prøve indsamling Anvende laboratorium påvisning af serum anti-AQP4 IgG til klinikken patienter med chef klager og symptomer nedenfor. Udføre fysiske undersøgelser så godt.Synsnervebetændelse: patienter lider med visuelle underskud, såsom tab af visuelle felter og reduktion af synsskarphed.Akut myelitis…

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne procedure her, specifikke anti-AQP4 IgG serum kan detekteres. Under proceduren, blev forud fortyndede prøver, positiv kontrol og negativ kontrol føjet til felterne reaktion, som indeholder transfekteret og untransfected områder (figur 2). Fluorescens af den negative kontrol i et transfected område er primært angivet uspecifik bindingen af sekundær antistof mod de transfected celler på biochips (figur 3</…

Discussion

Vi har beskrevet et bredt tilgængelige metode til påvisning af anti-AQP4 IgG i humant serum. Anti-AQP4 IgG er nært beslægtet med NMOSD, og om oprettelse af en pålidelig anti-AQP4 IgG påvisningsmetode er afgørende for den kliniske diagnose af NMOSD. Første er anti-AQP4 IgG specifikke for NMOSD. Multipel sklerose er også en immun-medieret sygdom i centralnervesystemet og deler mange ligheder med NMOSD¹². Anti-AQP4 IgG er imidlertid kun positive i NMOSD¹³. Andet, anti…

Materials

Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company