En musemodel at vurdere medfødte immunrespons for Staphylococcus aureus infektioner
Summary
En tilgang er beskrevet til real-time opdagelse af medfødte immun respons til kutane såret og Staphylococcus aureus infektion af mus. Ved at sammenligne LysM-EGFP mus (som besidder fluorescerende neutrofiler) med en LysM-EGFP krydset immundefekte mus stamme, vi fremme vores forståelse af infektion og udvikling af metoder til at bekæmpe infektion.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infektioner, herunder methicillin resistente pletter, er en enorm byrde på sundhedssystemet. Med forekomst af S. aureus infektion klatring årligt, er der et behov for yderligere forskning i sin sygdomsfremkaldende evne. Dyremodeller for smitsomme sygdomme fremme vores forståelse af vært-patogen svar og føre til udviklingen af effektiv terapi. Neutrofiler spille en primær rolle i medfødte immun reaktion, der styrer S. aureus infektioner ved at danne en byld at væg off infektion og lette bakteriel regnskabsafslutningen; antallet af neutrofiler, at infiltrere en S. aureus hudinfektion ofte korrelerer med sygdom resultat. LysM-EGFP mus, som besidder den forbedrede grøn fluorescerende protein (EGFP) indsat i lysozym M (LysM) promotor-regionen (udtrykt primært af neutrofiler), når det bruges sammen med in vivo hele dyr fluorescens imaging (FLI) giver en middel til at kvantificere neutrofile emigration noninvasively og på langs i såret hud. Når det kombineres med en en bioluminescerende S. aureus stamme og sekventiel in vivo hele dyr en bioluminescerende imaging (BLI), det er muligt at overvåge langs både neutrofile rekruttering dynamics og in vivo bakteriel byrde i stedet for infektion i bedøvede mus fra starten af infektionen til opløsning eller død. Mus er mere modstandsdygtige over for en række virulens faktorer produceret af S. aureus , der letter effektiv kolonisering og infektion hos mennesker. Immundefekte mus giver en mere følsomme dyremodeller for at undersøge vedvarende S. aureus infektioner og therapeutics evne til at øge medfødte immunrespons. Heri, karakterisere vi svar i LysM-EGFP-mus, der har været avlet til MyD88-mangelfuld mus (LysM-EGFP × MyD88– / – mus) sammen med wild-type LysM-EGFP mus at undersøge S. aureus hud sårinfektion. Multispektrale samtidige registrering aktiveret undersøgelse af neutrofile rekruttering dynamics ved hjælp af in vivo FLI, bakteriel byrde ved hjælp af in vivo BLI, og sårheling på langs og noninvasively over tid.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) tegner sig for størstedelen af hud og bløddele infektioner (SSTIs) i USA1. Forekomsten af methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infektioner er steget støt over de sidste to årtier2, motivere studier af mekanismerne af persistens og opdagelsen af nye behandling strategier. Standarden for pleje for MRSA-infektioner er systemisk antibiotikabehandling, men MRSA er blevet mere og mere resistente over for antibiotika over tid3 og disse stoffer kan mindske værtens gavnlige microbiome, forårsager negative sundhedsmæssige effekter, især i børn4. Prækliniske studier har undersøgt alternative strategier til at behandle MRSA infektioner5, men oversætte disse tilgange til klinikken har været udfordrende på grund af fremkomsten af virulens faktorer, at forpurre vært immunrespons6. For at dissekere vært-patogen dynamics drevet S. aureus SSTIs, kombinerer vi noninvasive og langsgående udlæsninger antal af neutrofiler rekrutteret til sår sengen med kinetic foranstaltninger af bakteriel overflod og sår område.
Neutrofiler er den mest rigelige cirkulerende leukocyt i mennesker og de første respondere til en bakteriel infektion7. Neutrofiler er et nødvendigt element for en effektiv host reaktion mod S. aureus infektioner på grund af deres bakteriedræbende mekanismer, herunder produktion af reaktive ilt arter, proteaser, antimikrobielle peptider og funktionelle løsninger herunder fagocytose og neutrofile ekstracellulære fælde produktion8,9. Menneskelige patienter med genetiske defekter i neutrofile funktion som kronisk granulomatøs sygdom og Chediak-Higashi syndrom, viser en øget modtagelighed for S. aureus infektioner. Derudover, patienter med genetiske (f.eks medfødt neutropeni) og erhvervet (såsom neutropeni ses hos patienter, kemoterapi) defekter i neutrofile numre er også meget modtagelige for S. aureus infektion10. Betragtning af betydningen af neutrofiler i clearing S. aureus infektioner, kan forbedring af deres immun kapacitet eller tuning deres tal inden for en S. aureus læsion bevise en effektiv strategi for at løse infektion.
I det sidste årti, er Transgene mus med fluorescens neutrofile journalister blevet udviklet for at studere deres handel med11,12. Kombinere neutrofile reporter mus med hele dyr Billeddannende teknikker tillader spatiotemporelle analyse af neutrofiler i væv og organer. Når det kombineres med en bioluminescerende stammer af S. aureus, er det muligt at spore ophobning af neutrofiler i svar til S. aureus overflod og persistens i forbindelse med bakteriel virulens faktorer der direkte og indirekte forurolige neutrofile numre i berørte væv13,14,15,16.
Mus er mindre modtagelige for S. aureus virulens og immun unddragelse mekanismer end mennesker. Som sådan, wild-type mus ikke kan være en ideel dyremodel til at undersøge effekten af et givet terapeutiske til behandling af kronisk S. aureus infektion. MyD88-mangelfuld mus (dvs., MyD88– / – mus), en immunkompromitterede mus stamme, der mangler funktionelle interleukin-1 receptor (IL-1R) og Toll-lignende receptor (TLR) signalering, Vis større modtagelighed for S. aureus infektioner sammenlignes Wild-type mus17 og en forringelse i neutrofile handel til en lokalitet af S. aureus infektion i huden18. Udvikling af en mus-stamme, der besidder en fluorescerende neutrofile reporter i MyD88– / – mus har givet en alternativ model for at undersøge effekten af terapier til behandling af S. aureus infektion i forhold til nuværende neutrofile reporter mus.
I denne protokol, vi karakterisere S. aureus infektion i immunsvækkede LysM-EGFP × MyD88– / – mus, og sammenligne tidsforløb og opløsning af infektion med LysM-EGFP-mus. LysM-EGFP × MyD88– / – mus udvikler en kronisk infektion, der ikke løser, og 75% bukke under for infektion efter 8 dage. En væsentlig fejl i indledende neutrofile rekruttering, der opstår over 72 h af den inflammatoriske fase af infektion, og 50% færre neutrofiler rekruttere under den sidste fase af infektion. Øget modtagelighed af LysM-EGFP × MyD88– / – mus gør dette bestemt stamme en streng prækliniske model til at vurdere effekten af nye terapeutiske teknikker rettet mod S. aureus infektion i forhold til aktuelle modeller udnytte wild-type mus, især teknikker med henblik på at øge den medfødte immunrespons mod infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus infektion modeller, der udnytter en bioluminescerende S. aureus infektion i en fluorescerende neutrofile reporter mus sammen med avancerede teknikker i hele dyr in vivo optisk tænkelig har avanceret vores viden om den medfødte immun reaktion på infektion. Tidligere undersøgelser ved hjælp af LysM-EGFP musen har vist, at op til 1 x 107 neutrofiler rekruttere til en S. aureus inficerede sår over de første 24 timer af infektion14og sår-rekrutter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud R01 AI129302 (til S.I.S.) og træningsprogram i farmakologi: fra bænken til Bedside ved UC Davis (NIH T32 GM099608 til L.S.A). Molekylær og genomisk Imaging (CMGI) på University of California Davis ydet fremragende teknologiske støtte.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
