Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion
Summary
Ein Ansatz ist für Echtzeit-Erkennung der angeborenen Immunantwort zu kutanen Verwundung und Staphylococcus Aureus Infektion der Mäuse beschrieben. Durch Vergleich LysM EGFP Mäuse (die fluoreszierenden Neutrophile besitzen) mit einem LysM EGFP immungeschwächte Maus Sorte gekreuzt, wir vorab unser Verständnis der Infektion und der Entwicklung von Ansätzen zur Bekämpfung der Infektion.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. Aureus) Infektionen, einschließlich Methicillin resistente Flecken sind eine enorme Belastung für das Gesundheitssystem. Mit Inzidenzraten von S. Aureus Infektionen jährlich Klettern gibt es ein Bedarf für weitere Forschung in ihrer Pathogenität. Tiermodelle der ansteckenden Krankheit unser Verständnis von der Wirt-Pathogen-Reaktion und zur Entwicklung wirksamer Therapeutika führen. Neutrophilen Rolle eine primäre bei der angeborenen Immunantwort, der S. Aureus -Infektionen durch die Bildung eines Abszesses bakterielle Abstand zu Wand aus die Infektion kontrolliert; die Zahl der Neutrophilen, die eine S. Aureus -Haut-Infektion oft infiltrieren korreliert mit Krankheit Ergebnis. LysM EGFP-Mäusen, die das erhöhte grüne fluoreszierende Protein (EGFP) eingefügt in das Lysozym M (LysM)-Promotor-Region (ausgedrückt in erster Linie durch Neutrophile) besitzen, in Verbindung mit in-vivo ganze Tier Fluoreszenz-Bildgebung (FLI) bieten eine Mittel zur Quantifizierung der Neutrophilen Auswanderung nicht-invasiv und längs in verletzte Haut. In Kombination mit einer Biolumineszenz S. Aureus Stamm und sequentielle in-vivo ganze Tier Biolumineszenz Imaging (BLI), es ist möglich, längs der Neutrophilen Rekrutierung Dynamik und in-vivo bakterielle Belastung auf dem Gelände des überwachen Infektion bei narkotisierten Mäuse vom Ausbruch der Infektion zur Auflösung oder zum Tod. Mäuse sind widerstandsfähiger gegen eine Reihe von Virulenzfaktoren von S. Aureus produziert, die effektive Kolonisation und Infektion in den Menschen zu erleichtern. Immungeschwächte Mäuse bieten ein empfindlicher Tiermodell untersuchen persistent S. Aureus Infektionen und die Fähigkeit der Therapeutika, angeborene Immunantwort zu steigern. Hierin, kennzeichnen wir Antworten in LysM EGFP-Mäusen, die mit MyD88-defizienten Mäusen (LysM EGFP × MyD88– / – Mäuse) gezüchtet wurden zusammen mit Wildtyp LysM EGFP-Mäusen, S. Aureus Haut Wundinfektionen zu untersuchen. Multispektrale simultane Detektion Studie der Neutrophilen Rekrutierung Dynamik mithilfe von in-vivo FLI, bakterielle Belastung mithilfe von in-vivo BLI aktiviert und Wundheilung längs und nicht-invasiv im Laufe der Zeit.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. Aureus) macht die Mehrheit der Haut- und Weichteilinfektionen (SSTI) in die Vereinigten Staaten1. Die Inzidenz von Methicillin-resistenten S. Aureus (MRSA) Infektionen stetig gestiegen in den letzten zwei Jahrzehnten2, motivieren die Untersuchung der Mechanismen der Persistenz und die Entdeckung neuer Behandlungsstrategien. Die Standardbehandlung für MRSA-Infektionen ist systemische Antibiotika-Therapie, aber MRSA über Zeit3 zunehmend Resistenzen gegen Antibiotika geworden ist und diese Medikamente können verringern des Gastgebers vorteilhaft Mikrobiom, wodurch negative gesundheitliche Auswirkungen, vor allem in Kinder von4. Präklinische Studien haben alternative Strategien zur Behandlung von MRSA-Infektionen5untersucht, aber übersetzen diese Ansätze in die Klinik erwies sich als schwierig wegen der Entstehung von Virulenzfaktoren, die Wirt Immune Antworten6vereiteln. Um die Wirt-Pathogen-Dynamik dieses Laufwerk S. Aureus SSTI sezieren, kombinieren wir nicht-invasive und längs Auslesen der Zahl der neutrophilen Granulozyten rekrutiert, das Wundbett mit kinetischen Maßnahmen der bakteriellen Fülle und Wunde Bereich.
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende zirkulierenden Leukozyten in den Menschen und die first Responder auf eine bakterielle Infektion-7. Neutrophile sind eine notwendige Komponente für eine effektive Wirtsantwort gegen S. Aureus Infektionen aufgrund ihrer bakteriziden Mechanismen, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, Proteasen, antimikrobielle Peptide und funktionale Antworten einschließlich der Phagozytose und Neutrophilen extrazelluläre Falle Produktion8,9. Menschliche Patienten mit genetischen Defekten in Neutrophilen Funktion, z. B. chronische granulomatöse Erkrankung und Chediak-Higashi-Syndrom, zeigen eine erhöhte Anfälligkeit für S. Aureus -Infektion. Darüber hinaus Patienten mit genetischen (z. B. angeborene Neutropenie) und erworbenen (z. B. Neutropenie bei Chemotherapiepatienten gesehen) Mängel in Neutrophilen-Zahlen sind auch sehr anfällig für S. Aureus -Infektion10. Angesichts der Bedeutung der Neutrophilen im clearing S. Aureus Infektionen, kann Ausbau ihrer immun oder tuning ihre Zahl innerhalb einer S. Aureus -Läsion eine wirksame Strategie zur Lösung Infektion erweisen.
Im letzten Jahrzehnt wurden transgene Mäuse mit Fluoreszenz Neutrophilenzahl Reporter entwickelt, um ihren Handel11,12zu studieren. Kombination von Neutrophilen Reporter Mäuse mit ganze Tier bildgebende Verfahren ermöglicht räumlich-zeitliche Analyse der Neutrophilen in Geweben und Organen. In Kombination mit Biolumineszenz Stämme von S. Aureusist es möglich, die Ansammlung von neutrophilen Granulozyten in Reaktion auf S. Aureus Fülle verfolgen und Persistenz im Zusammenhang mit bakteriellen Virulenz Faktoren, die direkt und indirekt Radardetektoren Sie Neutrophilenzahl Zahlen im betroffenen Gewebe13,14,15,16.
Mäuse sind weniger anfällig für S. Aureus Virulenz und Immune Evasion Mechanismen als Menschen. Als solche Wildtyp Mäusen möglicherweise nicht ideal Tiermodell untersucht die Wirksamkeit von einer Therapie zur Behandlung von chronischen S. Aureus gegeben Infektion. MyD88-defizienten Mäusen (d. h. MyD88– / – Mäuse), ein immungeschwächten Maus-Sorte, die funktionelle Interleukin-1 Rezeptor (IL-1R) und Toll-Like-Rezeptor (TLR) Signalisierung, zeigen größere Anfälligkeit für S. Aureus -Infektionen im Vergleich zu fehlen Wildtyp Mäusen17 und eine Wertminderung Neutrophilenzahl Menschenhandel zu einer Website von S. Aureus -Infektion in der Haut-18. Entwicklung eines Maus-Stamm, die einen fluoreszierenden Neutrophilenzahl Reporter in MyD88– / – Mäusen besitzt lieferte ein alternatives Modell zur Untersuchung der Wirksamkeit von Therapien zur Behandlung von S. Aureus -Infektionen im Vergleich zu aktuellen Neutrophilen Reporter-Mäuse.
In diesem Protokoll wir charakterisieren S. Aureus -Infektionen bei immungeschwächten LysM EGFP × MyD88– / – Mäusen, und vergleichen Sie die zeitlichen Verlauf und die Auflösung der Infektion mit den LysM EGFP-Mäusen. LysM EGFP × MyD88– / – Mäuse entwickeln eine chronische Infektion, die nicht behoben werden kann, und 75 % erliegen Infektion nach 8 Tagen. Eine bedeutende Defekt im anfänglichen Neutrophilenzahl Anwerbung über 72 h der entzündlichen Phase der Infektion, und 50 % weniger Neutrophile rekrutieren während der zweiten Phase der Infektion. Die erhöhte Anfälligkeit der LysM EGFP × MyD88– / – Mäusen macht das besondere Belastung ein rigoroses präklinisches Modell zur Bewertung der Wirksamkeit von neuen therapeutischen Techniken für S. Aureus -Infektionen im Vergleich zu aktuellen Modellen, die Nutzen Sie Wildtyp Mäusen, vor allem Techniken mit dem Ziel, die angeborene Immunantwort gegen eine Infektion zu steigern.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. Aureus Infektionsmodelle, die Biolumineszenz S. Aureus nutzen Infektion in eine fluoreszierende Neutrophilenzahl Reporter-Maus in Verbindung mit fortgeschrittenen Techniken der ganze Tier in-vivo optische Bildgebung haben unser Wissen über die angeborene fortgeschritten Immunantwort auf eine Infektion. Frühere Studien mit der Maus LysM EGFP haben gezeigt, dass bis zu 1 x 107 Neutrophile Rekruten einer S. Aureus infizierten Wunde in den ersten 24 h Infektion14</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien R01 AI129302 (zu S.I.S.) und das Trainingsprogramm in der Pharmakologie: von Bench to Bedside an der UC Davis (NIH T32 GM099608, L.S.A). Molecular and Genomic Imaging (CMGI) an der University of California Davis hat hervorragende technologische unterstützt.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
