דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus
Summary
גישה זו מתוארת זיהוי בזמן אמת של התגובה החיסונית מולדת ופצעו עורית, Staphylococcus aureus זיהום של עכברים. מאת LysM בהשוואת-EGFP עכברים (אשר מחזיקים נויטרופילים פלורסנט) עם LysM-EGFP crossbred immunodeficient עכבר זן, נוכל לקדם את ההבנה שלנו של זיהום ופיתוח של גישות כדי להילחם זיהום.
Abstract
Staphylococcus aureus זיהומים (S. aureus), לרבות עמיד methicillin כתמים, הם נטל עצום על מערכת הבריאות. עם שיעורי ההיארעות של זיהום S. aureus טיפוס מדי שנה, יש ביקוש נוספים במחקר שלה פתוגניות. מודלים חייתיים של מחלות זיהומיות לקדם את ההבנה שלנו של התגובה פתוגן-פונדקאי ולהוביל להתפתחות של הרפוי יעיל. נויטרופילים לשחק תפקיד ראשי התגובה החיסונית מולדת השולט S. aureus זיהומים על ידי יצירת מורסה קיר את הזיהום, להקל על חיסול חיידקים; המספר של נויטרופילים זה לחדור זיהום עור S. aureus לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם תוצאות המחלה. עכברים LysM-EGFP, אשר מחזיקים את משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) הוכנס האזור יזם ליזוזים מ’ (LysM) (לידי ביטוי בעיקר על ידי נויטרופילים), בעת שימוש בשילוב עם ויוו פלורסצנטיות כל חיה הדמיה (כאשר שגיא) לספק אמצעי לכימות הגירה נויטרופילים noninvasively ו longitudinally לתוך העור הפצוע. בשילוב עם ביולומנאסן S. aureus זן והדמיה רציפים ויוו כל בעלי חיים זוהרים (בלי), זה אפשרי לעקוב longitudinally dynamics גיוס נויטרופילים והן נטל חיידקי ויוו באתר של זיהום ומורדמת עכברים מן התחלה של זיהום רזולוציה או מוות. עכברים הם עמידים יותר בפני מספר גורמים התקפה אלימה המיוצר על ידי S. aureus המאפשרים קולוניזציה יעיל ולדלקת בבני אדם. עכברים immunodeficient מספקות מודל בעלי חיים רגיש יותר לבחון מתמשך S. aureus זיהומים ואת היכולת של הרפוי כדי להגביר את תגובות מערכת החיסון המולדת. במסמך זה, נוכל לאפיין תגובות בעכברים LysM-EGFP זה יש כבר וגדל לעכברים MyD88 לקויה (LysM-EGFP × MyD88– / – עכברים) יחד עם פראי-סוג עכברים LysM-EGFP לחקור זיהום הפצע העור S. aureus . זיהוי סימולטני מולטי ספקטריאליות מחקר של גיוס נויטרופילים dynamics באמצעות ויוו כאשר שגיא, נטל חיידקי באמצעות רבנות בלי ויוו, וההגדרה פצע ריפוי longitudinally, noninvasively לאורך זמן.
Introduction
Staphylococcus aureus (S . aureus) חשבונות עבור הרוב המכריע של העור וזיהומים רקמות רכות (SSTIs) ארצות הברית1. השכיחות של סטפילוקוקוס עמיד methicillin- S. aureus (MRSA) זיהומים גדל בהתמדה על העבר שני עשורים2, עידוד המחקר של המנגנונים של התמדה, הגילוי של אסטרטגיות טיפול חדשות. הטיפול לזיהומים MRSA הוא טיפול אנטיביוטי מערכתית, אבל MRSA הפכה יותר ויותר עמידים בפני אנטיביוטיקה במהלך הזמן3 , תרופות אלו יכולים להפחית microbiome מועיל של המחשב המארח, גרימת השפעות בריאותיות שליליות, בעיקר ילדים4. פרה מחקרים בחנו אסטרטגיות חלופיות לטיפול זיהומים MRSA5, אך בתרגום גישות אלה למרפאה הוכיח מאתגר בשל הופעתה של הגורמים התקפה אלימה לסכל מארח תגובות חיסוניות6. לנתח הדינמיקה פתוגן-מארח את הכונן SSTIs S. aureus , אנו משלבים לא פולשנית, המפרט האורך של המספר של נויטרופילים מגויס מיטת הפצע באמצעים קינטי השפע חיידקי פצע באזור.
הנויטרופילים הם ליקוציט במחזור הנפוץ ביותר בני האדם ואת המגיבים הראשונים זיהום חיידקי7. הנויטרופילים הם מרכיב הכרחי עבור מענה מארח יעיל נגד זיהומים S. aureus עקב מנגנונים אחרים שלהם, כולל הפקה של מינים חמצן תגובתי, פרוטאזות, פפטידים מיקרוביאלית ותגובות פונקציונלי לרבות phagocytosis נויטרופילים מלכודת חוץ-תאי ייצור8,9. בני אדם חולים עם פגמים גנטיים בתפקוד נויטרופילים, כגון מחלה גרגירומת ממושכת, תסמונת Chediak-היגאשי, מראים רגישות. מוגברת לזיהומים S. aureus . בנוסף, חולים עם גנטי (כגון נויטרופניה מולדים), שנרכש (כגון נויטרופניה לראות בחולים כימותרפיה) פגמים מספרים נויטרופילים הם גם רגישים מאוד S. aureus זיהום10. בהתחשב בחשיבות של נויטרופילים ב ניקוי S. aureus זיהומים, שיפור יכולת המערכת החיסונית שלהם או כוונון המספרים שלהם בתוך פצע S. aureus יוכיח אסטרטגיית יעיל בפתרון זיהום.
בעשור האחרון, העכברים הטרנסגניים עם כתבים נויטרופילים פלורסצנטיות פותחו ללמוד שלהם11,סחר12. שילוב כתב נויטרופילים עכברים עם כל החיות טכניקות הדמיה מאפשרת ניתוח זמן-מרחבי של נויטרופילים ב רקמות ואיברים. בשילוב עם זנים ביולומנאסן של S. aureus, ניתן לעקוב אחר ההצטברות של נויטרופילים בתגובה S. aureus שפע, התמדה בהקשר של התקפה אלימה חיידקי גורמים במישרין ובעקיפין perturb מספרים נויטרופילים הרקמה הנגועה13,14,15,16.
עכברים הם רגישים פחות התקפה אלימה S. aureus התחמקות מנגנוני החיסון מאשר בני אדם. ככזה, לא ייתכן פראי-סוג עכברים במודל חיה אידיאלי כדי לחקור את היעילות של בהתחשב טיפולית לטיפול כרוני S. aureus זיהום. MyD88 לקויה עכברים (קרי, MyD88– / – עכברים), זן העכבר immunocompromised חסר קולטן interleukin-1 תפקודית (IL-1R), אגרה דמוי קולטן (TLR) איתות, הצג רגישות גדולה יותר לזיהומים S. aureus בהשוואה פראי-סוג עכברים17 , ליקוי ב סחר נויטרופילים באתר של S. aureus זיהום העור18. התפתחות זן העכבר שמחזיק כתבת נויטרופילים פלורסנט בעכברים– / – MyD88 סיפקה מודל אלטרנטיבי לחקור את היעילות של טיפולים לטיפול זיהום S. aureus בהשוואה נויטרופילים הנוכחי כתב עכברים.
ב פרוטוקול זה, אנו מאפיינים את S. aureus זיהום בעכברים immunocompromised LysM-EGFP × MyD88– / – , להשוות את משך הזמן ואת הרזולוציה של זיהום עם העכברים LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88– / – עכברים לפתח דלקת כרונית אינה פותרת, 75% ללקות זיהום לאחר 8 ימים. פגם משמעותי בגיוס נויטרופילים הראשונית מתרחשת מעל 72 h בשלב דלקתיות של זיהום, 50% פחות נויטרופילים לגייס בשלב האחרון של זיהום. הרגישות מוגברת של × LysM-EGFP MyD88 עכברים– / – הופכת את המסוים זן דגם פרה קפדני כדי להעריך את היעילות של טכניקות טיפוליות חדשות מיקוד S. aureus זיהום לעומת הנוכחי מודלים זה לנצל פראי-סוג עכברים, במיוחד טכניקות במטרה לשפר את התגובה החיסונית המולדת מפני זיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus זיהום מודלים לנצל ביולומנאסן S. aureus זיהום ב עכבר כתב נויטרופילים פלורסנט בשילוב עם טכניקות מתקדמות של כל חיה דימות אופטי ויוו המתקדמת שלנו ידע מולד התגובה החיסונית לזיהום. מחקרים קודמים באמצעות העכבר LysM-EGFP הראו כי למעלה עונה 1 פרק 107 נויטרופילים לגייס כדי פצע מזוהם S. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים R01 AI129302 (כדי רפ), את תוכנית האימונים בפרמקולוגיה: מן הספסל אל מיטתה ב UC דייוויס (NIH T32 GM099608 אל L.S.A). מולקולרית של גנומית הדמיה (CMGI) ב אוניברסיטת קליפורניה דיוויס סיפק תמיכה טכנולוגית מעולה.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
