En musemodell å vurdere medfødte immunforsvaret til Staphylococcus aureus infeksjoner
Summary
En tilnærming er beskrevet for sanntids deteksjon av medfødte immunforsvaret til kutan såret og Staphylococcus aureus infeksjoner av mus. Ved å sammenligne LysM-EGFP mus (som har fluorescerende nøytrofile) med en LysM-EGFP crossbred immunodeficient musen belastning, vi forhånd vår forståelse av infeksjon og utvikling av tilnærminger til å bekjempe infeksjon.
Abstract
Gule stafylokokker (S. aureus) infeksjoner, inkludert meticillinresistante flekker, er en enorm belastning på helsevesenet. Med forekomst av S. aureus infeksjoner klatring årlig, er det et behov for ytterligere forskning i sin virusets. Dyr modeller av smittsomme sykdommer forhånd vår forståelse av vert-patogen svaret og føre til utvikling av effektive therapeutics. Nøytrofile spiller en primær rolle i medfødte immunforsvaret som styrer S. aureus infeksjoner ved å danne en byll å vegg av infeksjonen og tilrettelegge bakteriell klaring; antall nøytrofile som infiltrere en S. aureus hudinfeksjon ofte korrelerer med sykdom utfallet. LysM-EGFP mus, som har forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) i regionen for Lysozyme M (LysM)-arrangøren (uttrykt av nøytrofile), sammen med i vivo helt dyr fluorescens imaging (FLI) gir en måte å kvantifisere nøytrofile utvandring noninvasively og langs inn sårede huden. Kombinert med en bioluminescent S. aureus belastning og sekvensiell i vivo helt dyr bioluminescent imaging (BLI), er det mulig å overvåke langs både nøytrofile rekruttering dynamikk og i vivo bakterielle belastningen på stedet av infeksjon i bedøvet mus fra utbruddet av smitte til oppløsning eller død. Mus er mer motstandsdyktig mot en rekke virulens faktorer produsert av S. aureus som forenkler effektive kolonisering og infeksjon hos mennesker. Immunodeficient mus gir en mer følsomme dyr modell for å undersøke vedvarende S. aureus infeksjoner og evne til therapeutics å øke medfødte immunreaksjoner. Her har vi karakterisere svar i LysM-EGFP mus som har blitt avlet til MyD88 dårlig mus (LysM-EGFP × MyD88– / – mus) sammen med vill-type LysM-EGFP mus å undersøke S. aureus huden sår infeksjon. Multispectral samtidige oppdaging aktivert studiet av nøytrofile rekruttering dynamikken ved hjelp i vivo FLI, bakteriell byrden ved hjelp i vivo BLI, og sårtilheling langs- og noninvasively over tid.
Introduction
Gule stafylokokker (S. aureus) utgjør flertallet av hud og bløtvev infeksjoner (SSTIs) i USA1. Forekomsten av Meticillinresistente S. aureus (MRSA) infeksjoner økt jevnt over de siste to tiår2, motiverende studere mekanismer for utholdenhet og oppdagelsen av nye behandling strategier. Standarden på omsorg for MRSA-infeksjoner er systemisk antibiotika terapi, men MRSA har blitt stadig mer resistente mot antibiotika over tid3 og disse stoffene kan minske vertens gunstig microbiome, forårsaker negative helseeffekter, spesielt i barn4. Prekliniske studier har undersøkt alternative strategier for å behandle MRSA infeksjoner5, men oversette disse tilnærminger til klinikken har vist seg utfordrende på grunn av fremveksten av virulens faktorer som hindre vert immunreaksjoner6. For å analysere vert-patogen dynamikken stasjonen S. aureus SSTIs, vi kombinerer noninvasive og langsgående readouts antall nøytrofile rekruttert til såret sengen med kinetic tiltak for bakteriell overflod og såret området.
Nøytrofile er det rikeste sirkulerende leukocytt hos mennesker og de første responders til en bakteriell infeksjon7. Nøytrofile er en nødvendig komponent for en effektiv vert reaksjon mot S. aureus infeksjoner på grunn av deres bakteriedrepende mekanismer, inkludert produksjon av reaktive oksygen arter, proteaser, antimikrobielle peptider og funksjonelle svar inkludert fagocytose og nøytrofile ekstracellulære felle produksjon8,9. Menneskelige pasienter med genetiske defekter i nøytrofile funksjon, som kronisk granulomatøs sykdom og Chediak-Higashi syndrom, viser en økt mottakelighet for S. aureus infeksjoner. I tillegg pasienter med genetiske (for eksempel medfødt nøytropeni) og ervervet (for eksempel nøytropeni i kjemoterapi pasienter) feil i nøytrofile tall er også svært utsatt for S. aureus infeksjoner10. Gitt viktigheten av nøytrofile i clearing S. aureus infeksjoner, kan styrke deres immunforsvaret kapasitet eller tuning deres tall innenfor en S. aureus leksjonen være en effektiv strategi å løse infeksjon.
Det siste tiåret, er transgene mus med fluorescens nøytrofile journalister utviklet for å studere deres menneskehandel11,12. Kombinere nøytrofile reporter mus med hele dyr Bildeteknikker tillater spatiotemporal analyse av nøytrofile i vev og organer. Når kombinert med bioluminescent stammer av S. aureus, er det mulig å spore akkumulering av nøytrofile svar på S. aureus overflod og utholdenhet i sammenheng med bakteriell virulens faktorer som direkte og indirekte forurolige nøytrofile tall i berørte vev13,14,15,16.
Mus er mindre utsatt for S. aureus virulens og immun evasion mekanismer enn mennesker. Som sådan, vill-type mus kan ikke være en ideell dyremodell å undersøke effekten av en gitt terapeutisk å behandle kronisk S. aureus infeksjoner. MyD88 dårlig mus (dvs. MyD88– / – mus), en immunsupprimerte musen belastning som mangler funksjonelle interleukin-1 reseptor (IL-1R) og Toll-like reseptor (TLR) signalnettverk, Vis større mottakelighet for S. aureus infeksjoner sammenlignet vill-type mus17 og et verdifall i nøytrofile trafikken til et nettsted for S. aureus infeksjon i huden18. Utvikling av en mus stamme som besitter fluorescerende nøytrofile reporter i MyD88– / – mus har gitt en alternativ modell for å undersøke effekten av terapi for å behandle S. aureus infeksjoner sammenlignet med gjeldende nøytrofile reporter mus.
I denne protokollen, vi karakterisere S. aureus infeksjoner i immunsupprimerte LysM-EGFP × MyD88– / – mus, og sammenlign tid kurset og oppløsning av infeksjon med LysM-EGFP mus. LysM-EGFP × MyD88– / – mus utvikle en kronisk infeksjon som ikke løses, og 75% bukke til infeksjon etter 8 dager. En betydelig feil i første nøytrofile rekruttering skjer over 72 h av inflammatoriske fase av infeksjon, og 50% færre nøytrofile rekruttere under den siste fasen av infeksjon. Økt mottakelighet av LysM-EGFP × MyD88– / – mus gjør dette bestemt belastning en streng prekliniske modell for å evaluere effekten av nye terapeutiske teknikker målretting S. aureus infeksjoner sammenlignet med dagens modeller som bruke vill-type mus, spesielt teknikker å øke medfødte immunforsvaret mot infeksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus infeksjoner modeller som utnytter bioluminescent S. aureus infeksjoner i fluorescerende nøytrofile reporter mus sammen med avanserte teknikker i hele dyr i vivo optisk tenkelig har avansert vår kunnskap om den medfødte immun respons på infeksjon. Tidligere studier ved hjelp av LysM-EGFP-musen har vist at opp til 1 x 107 nøytrofile rekruttere til et S. aureus infiserte sår over de første 24 timer av14og såret-rekruttert nøytrofile utvide dere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse tilskudd R01 AI129302 (til S.I.S.) og treningsprogrammet i farmakologi: fra benken til sengen på UC Davis (NIH T32 GM099608 til L.S.A). Den molekylære og genomisk Imaging (CMGI) ved University of California Davis gitt suveren teknologisk støtte.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
