Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus
Summary
Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.
Abstract
Staphylococcus aureus Infecções (S. aureus), incluindo manchas resistentes à meticilina, são uma enorme sobrecarga para o sistema de saúde. Com taxas de incidência de infecção de S. aureus escalada anualmente, há uma demanda para a pesquisa adicional em sua patogenicidade. Modelos animais de doenças infecciosas avançam nossa compreensão da resposta do hospedeiro-patógeno e levam ao desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Os neutrófilos desempenham um papel primordial na resposta imune inata que controla infecções de S. aureus , formando um abscesso para parede a infecção e facilitar a remoção de bactérias; o número de neutrófilos que se infiltrar em uma infecção de pele de S. aureus , muitas vezes se correlaciona com o resultado de doença. Camundongos LysM-EGFP, que possuem a maior proteína verde fluorescente (EGFP) inserida na região promotora de lisozima M (LysM) (expressada principalmente por neutrófilos), quando usado em conjunto com imagens de fluorescência todo animal in vivo (FLI) fornecem um meios de quantificar a emigração dos neutrófilos canaliza e longitudinalmente na pele ferida. Quando combinado com um bioluminescentes S. aureus estirpe e sequencial imagem bioluminescente todo animal in vivo (BLI), é possível monitorar longitudinalmente a dinâmica do recrutamento de neutrófilos e vivo em carga bacteriana no local da infecção em ratos anestesiados desde precoce da infecção, a resolução ou a morte. Os ratos são mais resistentes a uma série de fatores de virulência produzido por S. aureus que facilitam a colonização eficaz e infecção em seres humanos. Camundongos imunodeficientes fornecem um modelo animal mais sensível para examinar persistente S. aureus infecções e a capacidade da terapêutica para impulsionar inatas respostas imunes. Neste documento, podemos caracterizar respostas em camundongos LysM-EGFP que foram criados para camundongos deficientes em MyD88 (LysM-EGFP × MyD88– / – ratos) juntamente com ratos de LysM-EGFP selvagem-tipo para investigar a infecção de ferida de pele de S. aureus . Multiespectral detecção simultânea habilitado o estudo da dinâmica de recrutamento dos neutrófilos usando FLI in vivo, carga bacteriana usando BLI in vivo e cicatrização longitudinalmente e de forma não invasiva ao longo do tempo.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) é responsável para a maioria das infecções na pele e tecidos moles (SSTIs) no Estados Unidos1. A incidência de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecções aumentou constantemente durante as últimas duas décadas2, motivando o estudo dos mecanismos de persistência e a descoberta de novas estratégias de tratamento. O padrão de atendimento para infecções por MRSA é antibioticoterapia sistêmica, mas MRSA tornou-se cada vez mais resistente aos antibióticos ao longo do tempo3 e estas drogas podem diminuir microbiome benéfico do hospedeiro, causando efeitos negativos para a saúde, especialmente em crianças4. Estudos pré-clínicos examinaram estratégias alternativas para tratamento de infecções de MRSA5, mas traduzir essas abordagens à clínica revelou-se um desafio devido ao surgimento de fatores de virulência que frustrar de respostas imunes do anfitrião6. Para dissecar a dinâmica hospedeiro-patógeno daquela unidade SSTIs de S. aureus , combinamos não invasiva e leituras longitudinais do número de neutrófilos recrutaram para o leito da ferida com medidas cinéticas de abundância bacteriana e ferida área.
Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundante nos seres humanos e as socorristas para uma infecção bacteriana7. Os neutrófilos são um componente necessário para uma resposta eficaz do hospedeiro contra S. aureus infecções devido a seus mecanismos bactericidas, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, proteases, peptídeos antimicrobianos e respostas funcionais incluindo a fagocitose e a produção de neutrófilos extracelular armadilha8,9. Pacientes humanos com defeitos genéticos na função dos neutrófilos, como a doença granulomatosa crônica e síndrome de Chediak-Higashi, mostram um aumento da susceptibilidade à infecção de S. aureus . Em adição, pacientes com genética (por exemplo, neutropenia congênita) e adquirida (como visto em pacientes de quimioterapia de neutropenia) defeitos em números de neutrófilos também são altamente suscetíveis a S. aureus infecção10. Dada a importância dos neutrófilos em compensação S. aureus infecções, aumentando a sua capacidade imune ou ajuste seus números dentro de uma lesão de S. aureus pode revelar uma estratégia eficaz na resolução de infecção.
Na última década, ratos transgénicos com repórteres de neutrófilos de fluorescência foram desenvolvidos para estudar seu tráfico de11,12. Combinar os ratos repórter neutrófilos com técnicas de imagem todo animais permite análise spatiotemporal de neutrófilos em tecidos e órgãos. Quando combinado com bioluminescentes cepas de S. aureus, é possível controlar o acúmulo de neutrófilos em resposta a abundância de S. aureus e persistência no contexto da virulência bacteriana fatores que direta e indiretamente perturb neutrófilos números no tecido afetado13,14,15,16.
Os ratos são menos suscetíveis a mecanismos de evasão de virulência e imune de S. aureus que os humanos. Como tal, ratos do selvagem-tipo não podem ser um modelo animal ideal para investigar a eficácia de um dado terapêutico para tratar a crônica de S. aureus infecção. Deficiência de MyD88 ratos (ou seja, MyD88– / – ratos), uma cepa de rato imunocomprometidos que carece de receptor funcional interleucina-1 (IL-1R) e Toll-like receptor (TLR) sinalização, mostrar maior susceptibilidade à infecção de S. aureus em comparação com rato do selvagem-tipo17 e um comprometimento em tráfico de neutrófilos para um site de S. aureus infecção na pele18. Desenvolvimento de uma cepa de rato que possui um repórter neutrófilos fluorescente no MyD88– / – ratos forneceu um modelo alternativo para investigar a eficácia de terapias para tratar a infecção de S. aureus em relação ao atual neutrófilos ratos de repórter.
Neste protocolo, podemos caracterizar a infecção de S. aureus nos imunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88– / – ratos e comparar a evolução temporal e resolução de infecção com os camundongos LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88– / – ratos desenvolvem uma infecção crônica que não resolve, e 75% sucumbem à infecção após 8 dias. Um defeito significativo no recrutamento de neutrófilos inicial ocorre mais de 72 h da fase inflamatória da infecção, e menos de 50% neutrófilos recrutam durante o último estágio da infecção. O aumento da susceptibilidade da LysM-EGFP × MyD88 ratos– / – isso torna particular Coe um rigoroso modelo pré-clínicos para avaliar a eficácia de novas técnicas terapêuticas visando a infecção de S. aureus em relação ao atual que modela Utilize o selvagem-tipo ratos, especialmente técnicas com o objetivo de aumentar a resposta imune inata contra infecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos de infecção de S. aureus que utilizam bioluminescentes S. aureus infecção em um rato de repórter neutrófilos fluorescente em conjunto com técnicas avançadas de imagem óptica em vivo todo animal tem nossa conhecimento avançado da inata resposta imune à infecção. Usando o mouse LysM-EGFP de estudos anteriores mostraram que acima de 1 x 107 neutrófilos recruta para uma ferida infectada de S. aureus durante as primeiras 24 horas de infecção14</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios R01 AI129302 (para s.i.s.) e o programa de formação em farmacologia: da bancada ao lado da cama na UC Davis (NIH T32 GM099608 para L.S.A). O Molecular e genômica Imaging (CMGI) na Universidade da Califórnia Davis fornecido suporte tecnológico soberbo.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
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