Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus
Summary
Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.
Abstract
Staphylococcus aureus Infecciones (S. aureus), incluyendo las manchas resistentes a la meticilina, son una enorme carga en el sistema de salud. Con tasas de incidencia de infección de S. aureus que sube anualmente, hay una demanda para la investigación adicional en su patogenicidad. Modelos animales de enfermedades infecciosas avanzan nuestro entendimiento de la respuesta del huésped-patógeno y conducen al desarrollo de la terapéutica eficaz. Neutrófilos juegan un papel primario en la respuesta inmune innata que controla las infecciones de S. aureus mediante la formación de un absceso de la pared la infección y facilitar la remoción bacteriana; el número de neutrófilos que infiltran a menudo una infección de la piel de S. aureus se correlaciona con el resultado de la enfermedad. Ratones LysM-EGFP, que poseen la mayor proteína verde fluorescente (EGFP) en la región del promotor lisozima M (LysM) (expresada sobre todo por los neutrófilos), cuando se utiliza junto con imágenes de fluorescencia de todo animal en vivo (FLI) proporcionan un medio de cuantificar la emigración de neutrófila no invasor y longitudinalmente en la piel herida. Cuando se combina con un bioluminiscente S. aureus cepa y secuencial en vivo todo animal bioluminiscente la proyección de imagen (BLI), es posible monitorizar longitudinalmente la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en vivo en el sitio de infección en ratones anestesiados de aparición de la infección a la resolución o la muerte. Los ratones son más resistentes a un número de factores de virulencia de S. aureus que facilitan la efectiva colonización y la infección en seres humanos. Ratones inmunodeficientes son un modelo animal más sensible para examinar persistente S. aureus las infecciones y la capacidad de la terapéutica para estimular la respuesta inmune innata. Aquí, se caracterizan las respuestas en ratones LysM-EGFP que han sido criados a los ratones deficientes en MyD88 (EGFP LysM × MyD88– / – ratones) junto con ratones de tipo salvaje LysM-EGFP investigar S. aureus piel infección de la herida. Detección simultánea multiespectral había habilitado estudio de dinámica de reclutamiento de neutrófilos mediante el uso de FLI en vivo, carga bacteriana mediante el uso de BLI en vivo y cicatrización longitudinalmente y no invasor con el tiempo.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) representa la mayoría de la piel y las infecciones de tejidos blandos (SETSI) en los Estados Unidos1. La incidencia de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecciones ha aumentado constantemente en los últimos dos décadas2, motivar el estudio de los mecanismos de persistencia y el descubrimiento de nuevas estrategias de tratamiento. El estándar del cuidado para las infecciones de MRSA es la terapia antibiótico sistémica, pero MRSA se ha convertido en cada vez más resistente a los antibióticos en tiempo3 y estas drogas pueden disminuir la microbioma beneficiosos del anfitrión, causando efectos negativos en la salud, especialmente en los niños4. Estudios preclínicos han examinado estrategias alternativas para el tratamiento de las infecciones de MRSA5, pero traducir estos enfoques a la clínica ha demostrado ser un reto debido a la aparición de factores de virulencia que frustrar anfitrión inmunorespuestas6. Para diseccionar la dinámica huésped-patógeno que impulsan S. aureus SETSI, combinamos no invasiva y longitudinales lecturas del número de neutrófilos reclutaron al lecho de la herida con medidas cinéticas de la abundancia bacteriana y área de la herida.
Neutrófilos son los leucocitos circulantes más abundantes en los seres humanos y los primeros respondientes a una infección bacteriana7. Neutrófilos son un componente necesario para una respuesta eficaz del anfitrión contra infecciones por S. aureus debido a sus mecanismos bactericidas, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno, proteasas, péptidos antimicrobianos y respuestas funcionales como fagocitosis neutrófilo trampa extracelular producción8,9. Pacientes humanos con defectos genéticos en la función del neutrófilo, como el síndrome de Chediak-Higashi, enfermedad granulomatosa crónica muestran una mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus . Además, los pacientes con genética (como la neutropenia congénita) y adquiridas (como la neutropenia en pacientes de la quimioterapia) defectos en los números de neutrófilos también son altamente susceptibles a la infección de S. aureus 10. Dada la importancia de los neutrófilos en la limpieza de las infecciones de S. aureus , potenciar su capacidad inmune o templar sus números dentro de una lesión de S. aureus puede resultar una estrategia eficaz en la resolución de la infección.
En la última década, se han desarrollado ratones transgénicos con reporteros neutrófilo fluorescencia para estudiar su tráfico de11,12. Combinación de ratones reportero neutrófilo con técnicas de imagen todo animales permite análisis espacio-temporales de los neutrófilos en los tejidos y órganos. Cuando se combina con bioluminiscentes cepas de S. aureus, es posible rastrear la acumulación de neutrófilos en respuesta a la abundancia de S. aureus y persistencia en el contexto de la virulencia bacteriana factores que directa e indirectamente perturbar el número de neutrófilo en el tejido afectado13,14,15,16.
Los ratones son menos susceptibles a S. aureus virulencia e inmune mecanismos de evasión que los seres humanos. Como tal, ratones de tipo salvaje no pueden ser un modelo animal ideal para investigar la eficacia de un dado terapéutica para el tratamiento crónico de S. aureus la infección. Ratones deficientes en MyD88 (es decir, MyD88– / – ratones), una cepa de ratón immunocompromised que carece de receptores funcionales de interleukin-1 (IL-1R) y Toll-like receptor (TLR) de señalización, mostrar mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus en comparación con ratones de tipo salvaje17 y un deterioro en el tráfico de neutrófilos al sitio de la infección de S. aureus en la piel18. Desarrollo de una cepa de ratón que posee un reportero fluorescente neutrófilo en ratones– / – MyD88 ha proporcionado un modelo alternativo para la investigación de la eficacia de terapias para tratar la infección de S. aureus en comparación con el actual recuento de neutrófilos ratones de reportero.
En este protocolo, caracterizan a la infección de S. aureus en los inmunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88– / – ratones y comparar la evolución temporal y la resolución de la infección con los ratones LysM-EGFP. MyD88– / – ratones de EGFP LysM × desarrollan una infección crónica que no se resuelve, y 75% sucumben a la infección después de 8 días. Un defecto importante en el reclutamiento inicial de neutrófilo ocurre más de 72 h de la fase inflamatoria de la infección, y reclutan neutrófilos de menos de 50% durante la última etapa de la infección. El aumento de la susceptibilidad del × LysM-EGFP MyD88– / – ratones hace que este particular colar un riguroso modelo preclínico para evaluar la eficacia de nuevas técnicas terapéuticas dirigidas a la infección por S. aureus en comparación con el actual modelos utilizar ratones de tipo salvaje, especialmente las técnicas con el objetivo de potenciar la respuesta inmune innata contra la infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos de infección de S. aureus que utilizan bioluminiscente S. aureus la infección en un ratón fluorescente reportera neutrófilo junto con técnicas avanzadas de proyección de imagen óptica in vivo todo animal ha avanzado nuestro conocimiento de lo innato respuesta inmune a la infección. Estudios anteriores utilizando el ratón LysM-EGFP han demostrado que hasta 1 x 107 neutrófilos recluta a una herida infectada de S. aureus en las primeras 24 h de infección<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el nacional institutos de salud becas R01 AI129302 (a SIS) y el programa de capacitación en farmacología: de banco a cabecera en UC Davis (NIH T32 GM099608 a L.S.A). Molecular y genómica Imaging (CMGI) en la Universidad de California en Davis proporcionan excelente soporte tecnológico.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
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