תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר
Summary
ההורמון מופרש על ידי קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות החולדה הראשית תאי בלוטת יותרת הכליה. זה יכול להיות פלטפורמה במבחנה טוב עבור חוקרים את המנגנונים מהתרכובת עניין steroidogenesis בלוטת יותרת הכליה, ביוסינטזה השומנים.
Abstract
ההורמון מפריש קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. השיטה המתוארת כאן היא ההליך העיקרי עכברוש בתרבית תאים בלוטת יותרת הכליה, קשורים מבחני פונקציונלי (immunofluorescence צביעת של השומנים droplet הדם, כמו גם ניתוח corticosterone). בניגוד מודל ויוו, הווריאציות של interexperiments בתרבויות טפט יותרת הכליה הוא פחות ואת התנאי ניסיוני הוא קל לשלוט בהם. חוץ מזה, המקור של חולדות יציב גם יותר חיות אחרות, כמו שור אלה. ישנם גם שורות תאים אנושיים יותרת הכליה מספר (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, וכו ‘) יכול לשמש במחקרים בלוטת יותרת הכליה. עם זאת, ייצור הסטרואידים שורות אלה עדיין תושפע גורמים רבים, אשר כוללים מספר הרבה בסרום, מעבר מספר, חשבונאי/הפסד של גנים שונים, וכו ‘. פרט חסר 17α-hydroxylase, התרבות העיקרי של תאים adrenocortical חולדה היא טכניקה יותר טוב ונוח יותר עבור לימודי פיזיולוגיה של הכליה. לסיכום, תרבויות האדרנל החולדה הראשית יכולה להיות פלטפורמה במבחנה טוב לחוקרים לחקור את המנגנונים מהתרכובת של עניין במערכת בלוטת יותרת הכליה.
Introduction
המערכת האנדוקרינית אחראי על ויסות פעילות פיזיולוגית והומאוסטזיס1. יותרת הכליה ממוקם בקוטב הגולגולת של הכליות הן אחד האיברים האנדוקרינית הגדולות אשר מפרישים mineralocorticoids, glucocorticoids ו-2,אנדרוגן3. ישנם שני חלקים ברורים של בלוטת יותרת הכליה: קליפת המוח, לשד. קליפת יותרת הכליה מורכבת משלוש שכבות: את glomerulosa החיצוני של fasciculata ביניים, את reticularis הפנימי3. Glomerulosa zona הוא אתר מפרישים המקורי של אלדוסטרון, מינרלוקורטיקואידים, אשר מסייע להתפתחות reabsorbing יון נתרן ומים של הכליות3. Fasciculata zona מייצרת בעיקר לרמת הבסיס glucocorticoids נורמלי בתנאים פיזיולוגיים3. קורטיקוסטרואידים בחולדות, קורטיזול אצל בני אדם לפעול כדי לסייע לגוף להתמודד עם הלחץ על ידי ויסות גלוקוז בדם3. במידה מסוימת, הם יכולים לעכב תגובות דלקתיות, לווסת את המערכת החיסונית4,5. בניגוד יונקים אחרים, עכברים וחולדות אין reticularis zona פונקציונלי בשל היעדר ביטוי 17α-hydroxylase ב6,7בלוטת יותרת הכליה. לפיכך, האנדרנלין של עכברים וחולדות אין ההפרשה של סטרואידים C-19 יותרת הכליה (קורטיזול ואנדרוגנים האדרנל).
ראשי בתרבית תאים adrenocortical הוכחו להיות שימושי עבור חוקרים מנגנוני שליטה על פיזיולוגיה של הכליה8. כמו רקמות אחרות שחלת בקר, כל אזור בלוטת יותרת הכליה מסנתז שלה סטרואידים כולסטרול חינם9. על גירוי הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (זינק), רמת הכולסטרול חינם הוא שוחרר מן פירוק השומנים טיפות, לפיכך, מגביר את ייצור הסטרואידים ב- fasciculata ו- reticularis10.
קבוצות רבות ניסו ליצור שורות תאים יציבה מן adrenocortical קרצינומות. עם זאת, מספר חששות מוגבלת השימוש של שורות תאים adrenocortical כמו דגמים חוץ גופית8. התגובות סטרואידים של שורות תאים עשויים להיות שונים בין הקטעים, מספר גדול של סרום איכות סרום, וכו ‘. יתר על כן, שורות תאים בלוטת יותרת הכליה מסחרי (Y1 ו- SW13) לא מפרישים corticosterone, וכך קשה יותר ללמוד האדרנל steroidogenesis8. באמצעות האדרנלים שור, הרכיבה כפי שמחוץ מודלים עשוי להיות בחירה טובה, אף-על-פי רקמות מן בשווקים אלה עשוי לטשטש כמה סיכונים לא ידועים. בהשוואה אליהם, ניהול עכברוש יותרת הכליה קל והוא המקור יחסית יותר יציבה ונטולת הפתוגן. יחדיו, נוכח השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לחקור את מנגנון הקשור של סינתזה corticosterone בתאי בלוטת יותרת הכליה fasciculata חולדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בלוטת יותרת הכליה לשחק תפקיד מפתח הסתגלות סביבתית3. שבו קליפת יותרת הכליה מפרישה את ההורמון יכול לווסת ולהתאים פונקציות פיזיולוגיים והומאוסטזיס3. המודל ויוו משקף את ההשפעות הפיזיולוגיות מאוד בגוף. עם זאת, זה עדיין מושפע על ידי גורמים מורכבים רבים, גרימת תופעות לא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של טייוואן המועצה הלאומית למדע (NSC102-2320-B-037-008-MY3) ואת הלאומית צ’נג קונג אוניברסיטת בית החולים במענק מחקר (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. . Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
