التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT)، تكنولوجيا تصوير ثلاثي الأبعاد، استخدمت لرصد وتوصيف حركية النمو من الماغنيسيوم متعددة الخلايا السرطانية. وقد عرضت دقيقة التحديد الكمي الحجمي الماغنيسيوم الورم باستخدام فوكسل عد النهج، والكشف عن الأنسجة ميتة خالية من التسمية في الماغنيسيوم استناداً إلى التباين التوهين البصري الجوهرية،.
وقد وضعت الماغنيسيوم الورم كنموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خلية ثقافة في اكتشاف الأدوية المضادة للسرطان والبحوث السرطان. حاليا، الفائق التصوير طرائق استخدام الكشف الميداني أو الأسفار مشرق، غير قادر على حل عموما 3D هيكل كروي الورم بسبب تغلغل الخفيفة المحدودة، نشر الأصباغ الفلورية و عمق-ريسولفابيليتي. في الآونة الأخيرة، أظهرت لدينا مختبر استخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT)، خالية من التسمية وغير مدمرة، 3D التصوير أسلوب القيام بتوصيف طولية من الماغنيسيوم متعددة الخلايا السرطانية في صفيحة 96-جيدا. أكتوبر كان قادراً على الحصول على معلومات الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية 3D من الماغنيسيوم الورم النمو يصل إلى حوالي 600 ميكرون في الطول. في هذه المقالة، نبدي أكتوبر (تشرين الأول/أكتوبر HT) الفائق نظام تصوير بفحص لوحة كاملة متعددة جيدا، ويحصل على بيانات أكتوبر ثلاثية الأبعاد من الماغنيسيوم الورم تلقائياً. يصف لنا تفاصيل المبادئ التوجيهية HT-أكتوبر النظام والبناء في البروتوكول. من بيانات أكتوبر 3D، واحد يمكن تصور الهيكل العام كروي مع 3D المقدمة وشرائح متعامد، تميز منحنى النمو الطولي كروي الورم استناداً إلى المعلومات المورفولوجية للمساحة والحجم، ورصد نمو مناطق الميت-خلية كروي الورم استناداً إلى التباين التوهين مضمن بصري. نظهر أن HT-أكتوبر يمكن استخدامها كطريقة تصوير الفائق للمخدرات الفرز، فضلا عن وصف العينات بيوفابريكاتيد.
السرطان هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في العالم1. وضع المخدرات تستهدف السرطان من الأهمية بالنسبة للمرضى. ومع ذلك، يقدر أن أكثر من 90 في المائة عقاقير المضادة للسرطان الجديدة تفشل في مرحلة التطوير بسبب عدم فعالية وسمية غير متوقعة في التجارب السريرية2. جزء من السبب الذي يمكن أن يعزى إلى استخدام نماذج الثقافة خلية ثنائية الأبعاد (2D) بسيطة لفحص المركبة، التي توفر النتائج مع القيم التنبؤية محدودية نجاعة المركب وسمية للمراحل التالية ل اكتشاف المخدرات2 , 3 , 4. في الآونة الأخيرة، تم تطوير نماذج كروي الورم ثلاثي الأبعاد (3D) لتوفير البيانات ذات الصلة سريرياً الفسيولوجية والدوائية لعقار مضاد للسرطان اكتشاف3،،من45 ،6،،من78،9،10،11،،من1213،14، 15،16،17،،من1819،20،21،،من2223، 24،25. حيث يمكن أن تحاكي هذه الماغنيسيوم الخصائص الخاصة بالانسجة من الأورام في فيفو، مثل المغذيات والأكسجين التدرج، التاكسج الأساسية، فضلا عن العقاقير المقاومة19، استخدام هذه النماذج يمكن أن يحتمل أن تقصير مواعيد اكتشاف المخدرات، تقليل تكاليف الاستثمار، وجلب أدوية جديدة إلى المرضى أكثر فعالية. نهج نقدي واحد لتقييم فعالية المركب في التنمية كروي الورم 3D لرصد النمو كروي وتكرار تحت العلاج9،26. للقيام بذلك، لا بد من الأوصاف الكمية مورفولوجيا الورم، تتعلق القطر والحجم، مع طرائق التصوير عالي الدقة،.
طرائق التصوير التقليدية، مثل مشرق الميدانية ومرحلة التباين7،9،،من2224fluorescence مجهرية8،،من916، 18،22 يمكن أن توفر مقياسا للقطر كروي ولكن لا يمكن حل الهيكل العام كروي في الفضاء ثلاثي الأبعاد. هناك عوامل كثيرة تؤدي إلى هذه القيود، بما في ذلك اختراق الضوء السبر في كروي؛ نشر الأصباغ الفلورية إلى كروي؛ التي تنبعث منها إشارات مضيئة من الأصباغ الفلورية متحمس داخل أو على سطح كروي بسبب امتصاص القوى ونثر؛ المعاكس والتصوير ريسولفابيليتي عمق هذه الطرائق. وهذا غالباً ما يؤدي إلى قياس حجم غير دقيقة. التنمية الأساسية نخرية في الماغنيسيوم يحاكي نخر في فيفو الأورام6،،من1015،،من1925. تعتبر هذه الميزة المرضية غير المحتمل المستنسخة في 2D خلية الثقافات19،25،،من2728. مع حجم كروي أكبر من 500 ميكرومتر في القطر، وهيكل ثلاثة طبقة متحدة مركز، بما في ذلك طبقة خارجية من الخلايا المتكاثرة، وطبقة وسطى من خلايا هادئة، ونواة نخرية، يمكن ملاحظتها في كروي6،10 ،،من1519،25، بسبب نقص الأوكسجين والمواد المغذية. الخلية الحية والميتة fluorescence التصوير هو نهج موحد لتسمية الحدود الأساسية نخرية. بيد مرة أخرى، اختراقات لكل هذه الأصباغ الفلورية والضوء المرئي تعوق القدرة على التحقيق في صلب نخرية لرصد تطورها في شكلها الفعلي.
3D بديلة التصوير طريقة، هو عرض التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) لتوصيف الماغنيسيوم الورم. أكتوبر هو تقنية تصوير الطبية غير قادرة على الحصول على بيانات 3D خالية من التسمية، وغير المدمرة من يصل إلى عمق 1-2 مم في الأنسجة البيولوجية29،،من3031،،من3233 ،34. أكتوبر توظف التداخلي تماسك منخفضة كشف الإشارات المنتشرة في الظهر من أعماق مختلفة من العينة وتوفر الصور حل عمق أعيد بناؤها في قرارات ميكرون-المستوى المكاني في الاتجاهين الأفقي والرأسي على حد سواء. أكتوبر قد اعتمدت على نطاق واسع في طب العيون35،،من3637 والأوعية38،39. واستخدمت الدراسات السابقة أكتوبر لمراقبة مورفولوجية في المختبر الماغنيسيوم ورم في الغشاء مصفوفة (مثلاً، ماتريجيل) وتقييم استجاباتها للعلاج الضوئي40،41. في الآونة الأخيرة، لدينا فريق منصة تصوير أكتوبر الفائق بمنهجية رصد وقياس حركية النمو للورم 3D الماغنيسيوم في لوحات متعددة جيدا42. وقد عرضت دقيقة التحديد الكمي الحجمي الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام فوكسل عد النهج وكشف النسيج المتنخر خالية من التسمية في الماغنيسيوم استناداً إلى التباين التوهين البصري الجوهرية. وتصف هذه الورقة تفاصيل كيف كان شيدت منصة التصوير في أكتوبر والمستخدمة للحصول على صور عالية الدقة 3D من الماغنيسيوم الورم. ويرد وصف التحليلات الكمية خطوة بخطوة لحركية النمو من الماغنيسيوم الورم ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك قياسات دقيقة لوحدات التخزين، وقطرها كروي. ويرد أيضا، طريقة الكشف عن مناطق النسيج المتنخر استخدام OCT، استناداً إلى التباين التوهين البصري الأصيلة غير المدمرة.
نشاط الورم ارتباطاً وثيقا ببنيتها المورفولوجية. مماثلة لرصد منحنى النمو المميزة للثقافات الخلية 2D، تتبع منحنى النمو للورم 3D الماغنيسيوم أيضا نهج التقليدي لوصف سلوك النمو كروي طويل الأجل لخطوط خلايا مختلفة. الجدير بالذكر أننا تميز رد المخدرات عن طريق تحليل تدهور ورم أو نمو الورم بشكل مبا?…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها جبهة الخلاص الوطني يمنح إيدبر (DBI-1455613)، PFI:AIR-ترينيداد وتوباغو (IIP-1640707)، وصندوق المنح R21EY026380 و R15EB019704 و R01EB025209، وجامعة ليهاي المعاهد الوطنية للصحة لبدء التشغيل.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |