Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현
Summary
뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.
Abstract
뼈는 골세포, 골세포 및 파골세포로 구성된 결합 조직이며, 미네랄화된 세포외 매트릭스로 강도와 유연성을 제공하고 그 기능을 수행할 수 있게 합니다. 뼈는 병리학 적 조건에서 뼈 리모델링을 조절 할 수있는 다양한 자극에 지속적으로 노출됩니다. 뼈 생물학 및 질병을 연구하고 잠재적인 치료제를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다.
이 원고는 뼈 형성 및 뼈 종양 미세 환경을 연구하기 위해 신생아 마우스로부터 분리 된 calvarias의 해부 과정 및 배양 조건을 설명합니다. 시험관 내 및 생체 내 모델과는 달리, 이 ex vivo 모델은 정의된 조건하에서 배양하는 동안 조직의 3차원 환경뿐만 아니라 뼈의 세포 다양성을 보존하여 원하는 미세 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. 따라서, 뼈 리모델링 및 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다., 다른 세포 유형과의 상호 작용 뿐만 아니라, 암 세포와 뼈 사이 상호 작용 등.
여기에서 보고된 분석은 5-7 일 오래된 BALB/C 마우스에서 calvarias를 이용합니다. 수득된 헤미-칼바리아는 인슐린, 유방암 세포(MDA-MB-231) 또는 유방암 세포 배양으로부터 조절된 배지의 존재하에 배양된다. 분석 후, 인슐린이 새로운 뼈 형성을 유도하는 것으로 확립되었으며, 암세포와 이들의 조절된 배지는 뼈 흡수를 유도하였다. calvarial 모형은 뼈 발달 및 암 유도한 뼈 질병을 공부하기 위하여 기초그리고 적용한 연구에서 성공적으로 이용되었습니다. 전반적으로, 그것은 쉬운, 유익한, 그리고 저렴 한 비용 분석에 대 한 훌륭한 옵션.
Introduction
뼈는 근육을 지원하고, 내부 장기와 골수를 보호하고, 칼슘과 성장 인자를 저장 및 방출하는 등 여러 기능을 가지는 동적 결합조직1,,2. 무결성과 적절한 기능을 유지하기 위해 뼈 조직은 리모델링 과정에서 지속적으로 진행됩니다. 일반적으로, 뼈 리모델링의 주기는 뼈 재흡수와 뼈 형성으로 나눌 수 있습니다1. 뼈 리모델링의 이 2단계 사이 불균형은 뼈 병리의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, 유방암과 같은 질병은 종종 뼈의 무결성에 영향을 미칩니다. 진보된 단계에 있는 환자의 대략 70% 이상은 뼈 전이가 있을 것입니다. 유방암 세포가 뼈에 들어가면 뼈 대사에 영향을 미치고 과도한 흡수 (파골 세포 병변) 및 / 또는 형성 (골아세포병변)3.
뼈 질환의 생물학을 이해하고 새로운 치료법을 개발하려면 뼈 리모델링과 관련된 메커니즘을 이해해야합니다. 암 연구에서, 뼈 전이 과정 및 전이성 미세 환경과의 관계를 조사하는 것이 필수적입니다. 1889년, 스티븐 파짓은 종양 세포와 표적 조직 사이에 호환성이 있을 때 전이가 발생한다고 가설하고, 전이성 부위는 미세환경4에대한 종양의 친화도에 의존한다고 제안했다. 1997년, 문디와 기즈는 종양 세포가 생존과 성장을 달성하기 위해 뼈 미세 환경을 수정하는 방법과 뼈 미세 환경이 칼슘과 성장 인자를 제공함으로써 성장을 촉진하는 방법을 설명하기 위해 “뼈 전이의 악순환”의 개념을도입했다 5,,6,,7.
뼈 리모델링 및 뼈 전이에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 가능한 치료 잠재력을 가진 분자를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다. 그러나, 이러한 모델은 현재 뼈 미세 환경의 단순화 된 표현과 같은 많은 제한사항을 제시하고, 그 비용8,,9. 생체내 외형의 ex vivo 배양은 골세포의 다양성뿐만 아니라 3차원 조직을 유지하는 장점이 있다. 또한, 실험 조건을 제어할 수 있다. 이식 모델은 중족골 뼈, 대퇴머리, 칼바리아, 하악골 또는 근체 또는 궤적코어(10)의배양을 포함한다. ex vivo 모델의 장점은 다양한 연구에서 입증되었습니다. 2009년, Nordstrand 및 협력자들은 뼈와 전립선암 세포 사이의 상호 작용에 기초하여 동문화 모델의 확립을 보고했다11. 또한, 2012년, 커틴과 협력자들은 생체내 코컬쳐12를이용한 3차원 모델의 개발을 보고했다. 이러한 생체내 모델의 목적은 정상 또는 병리학적 뼈 리모델링에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 새로운 치료제의 효능을 평가할 수 있도록 가능한 한 정확하게 뼈 미세환경의 조건을 재현하는 것이다.
본 프로토콜은 Garrett13 및 Mohammad et al.14에의해 출판된 절차를 기반으로 합니다. 신생아 마우스 calvaria 배양체는 성숙한 파골세포및 파골세포로 이어지는 모든 분화 단계(즉, 골세포, 파골세포, 골혈계, 기질 세포)를 포함하여 발달 중인 뼈및 골세포의 3차원 구조를 유지하면서 실험 모델로 사용되어 왔으며, 이는 광물화된 미네랄화매트릭스뿐만아니라 1.000.00.1이다. ex vivo 모델은 뼈 질환의 병리학 적 과정을 완전히 나타내지 않습니다. 그러나, 뼈 리모델링 또는 암 유발 뼈 골용해에 미치는 영향을 정확하게 측정할 수 있습니다.
간략하게, 이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다: 5-7일 된 마우스에서 calvarias의 해부, calvaria preculture, calvaria 배양 응용 프로그램 (예를 들면, 인슐린의 존재에 있는 배양, 암세포 또는 조건부 배지, 및 에이전트를 가진 조차 치료 잠재력, 조사의 목적에 따라), 뼈 고정 및 calvaria decalcification, 조직 처리, 조직 분석 및 결과 해석.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 뼈 형성 또는 재흡수를 평가하고 calvarial 마우스 뼈를 가진 암세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 calvarial ex 생체 모델을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 기술의 중요한 단계는 칼바리아의 해부, 문화, 포함 및 조직 형성 분석입니다. 칼라핀 을 포함하는 동안 방향을 강하게 촉진하기 때문에 칼바리아를 사다리꼴로 자르는 것이 중요합니다. calvarias와 암 세포 상호 작용을 공…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 마리오 노무라, M.D. 및 로돌포 디아즈가 역학에 도움을 준 것에 대해 감사를 표하고, 피에릭 푸르니에 박사는 논문의 품질을 향상시키기 위해 그의 귀중한 의견에 감사를 표합니다.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
