हम तरल और ठोस ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने वाले चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो साइटोलिसिस परख प्रणाली में एक मात्रात्मक वास्तविक समय का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं के साथ-साथ संयोजन उपचार का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
कैंसर के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी-सेल थेरेपी ने प्रतिरोधी और रिफ्रैक्टरी हेमेटोलॉजिकल घातक घातक घातक के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक लाभ हासिल किया है जैसे बचपन तीव्र लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया। वर्तमान में अन्य हेमेटोलॉजिकल कैंसर के अलावा ठोस ट्यूमर के लिए इस होनहार चिकित्सा का विस्तार करने के प्रयास चल रहे हैं । यहां, हम ठोस और तरल ट्यूमर कोशिकाओं पर अद्वितीय या तरजीही अभिव्यक्ति के साथ एंटीजन को लक्षित शक्तिशाली कार टी कोशिकाओं के विकास और उत्पादन का वर्णन करते हैं। इन कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति का मूल्यांकन वास्तविक समय में अत्यधिक संवेदनशील बाधा आधारित xCELLigence परख का उपयोग करके किया जाता है। विशेष रूप से, कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति पर ग्लूकोकॉर्टिकोइड-प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर (टीएनएफआर) से संबंधित प्रोटीन (जीआईटीआर) जैसे विभिन्न कोस्टिमुलरी सिग्नलिंग डोमेन के प्रभाव की जांच की जाती है। इस रिपोर्ट में प्रोटोकॉल शामिल हैं: लेंटिवायरल जीन ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए कार टी कोशिकाओं का सृजन करना, कार टी कोशिकाओं का विस्तार करना, कार अभिव्यक्ति को मान्य करना, और xCELLigence शक्ति परख ों को चलाना और विश्लेषण करना।
हाल के वर्षों में, कार टी-सेल थेरेपी रिलेप्स्ड और रिफ्रैक्टरी हेमेटोपोइटिक द्रोह के लिए कैंसर इम्यूनोथेरेपी में सबसे प्रमुख सफलताओं में से एक रही है। हाल ही में अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के अनुमोदन के साथ CD19 के अनुमोदन-तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया के लिए कार टी कोशिकाओं का निर्देश दिया, गैर हॉगकिन लिंफोमा, और बड़े बी-सेल लिंफोमा को फैलाना, और बी-सेल परिपक्वता एंटीजन (BCMA) के लिए सफलता चिकित्सा का पदनाम- कई मायलोमा के लिए कार टी कोशिकाओं का निर्देश दिया गया है, इस तकनीक ने वैज्ञानिक समुदाय में बहुत उत्साह पैदा किया है और दुनिया भर मेंकईबुनियादी, लागू और नैदानिक अध्ययनों को शह दी है1,2,3, 4,5. 2019 के जनवरी में, नैदानिक परीक्षण डेटाबेस (clinicaltrials.gov) में 700 से अधिक नैदानिक परीक्षण पंजीकृत किए गए थे; इन परीक्षणों के बारे में ४५० या तो शुरू करने के बारे में थे या सक्रिय रूप से रोगियों की भर्ती कर रहे थे । अधिकांश नैदानिक परीक्षण हेमेटोलॉजिकल घातक क्षमताओं पर केंद्रित हैं, और सीडी 19 के अलावा सीडी 20, सीडी22 और बीसीएमए को लक्षित करने वाली कार टी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले नैदानिक परीक्षण6,7भी चल रहे हैं। जबकि परीक्षणों के अधिकांश ऑटोलोगस कार टी सेल थेरेपी का उपयोग कर रहे हैं, उनमें से एक महत्वपूर्ण संख्या भी एलोजेनिक कार टी कोशिकाओं8,9,10की उपयोगिता की खोज कर रहे हैं । हेमेटोलॉजिकल घातक के साथ आशाजनक परिणामों के बावजूद, ठोस ट्यूमर को लक्षित करने के लिए कार टी कोशिकाओं का उपयोग कई कारणों से क्लिनिक में बहुत अधिक कठिन साबित हुआ है, जिसमें ट्यूमर में विशेष रूप से व्यक्त किए गए अच्छे लक्ष्यों की कमी तक सीमित नहीं है, ठोस ट्यूमर और ट्यूमर “एस्केप” की विषमता, और कठिनाई है कि कार टी कोशिकाओं ट्यूमर माइक्रोएनवायरन 11,12,14, 14, 15.ठोस ट्यूमर विशिष्ट कार टी कोशिकाओं के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है जो प्रभावकारिता के लिए इन बाधाओं को दूर कर सकते है और “लक्ष्य पर ट्यूमर” विषाक्तता की समस्या । जबकि इन विट्रो और वीवो दृष्टिकोणों की एक भीड़ कार टी कोशिकाओं के डिजाइन और परीक्षण में आवश्यक है, एक मजबूत और भविष्य कहनेवाला इन विट्रो शक्ति परख प्राथमिक महत्व16,17का है।
कार टी कोशिकाओं की शक्ति का आकलन करने के लिए, विभिन्न इन विट्रो विधियों को विकसित किया गया है। सामान्य तौर पर, इन शक्ति परखों को दो व्यापक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है जो इस बात पर निर्भर करता है कि क्या वे(i)सीधे लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की साइटोलिटिक गतिविधि को मापते हैं, या(ii)सरोगेट मार्कर जैसे साइटोकिन्स को मापते हैं जो कार टी कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाते हैं क्योंकि वे लक्ष्य कोशिकाओं को मारते हैं। साइटोलिटिक गतिविधि को मापने वाली तकनीकों में क्रोमियम-51 रिलीज परख (सीआरए)18,इमेजिंग-आधारित परख शामिल हैं जो फ्लोरोसेंट जांच19,20का उपयोग करके लक्षित कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को मापते हैं, और साइटोमेट्री परख ों का उपयोग करते हैं जो अपोप्टोटिक लक्ष्य कोशिकाओं का पता लगाते हैं21। इन परखों में, कार टी कोशिकाओं को आम तौर पर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी किया जाता है जिन्हें रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंट जांच के साथ पूर्व-लेबल किया गया है, जिसके बाद उचित माप होता है। हालांकि यह लंबे समय से अपनी संवेदनशीलता के कारण क्षेत्र में सोने के मानक माना जाता रहा है, सीआरए कुछ कमियां है । सबसे पहले, यह एक एंडपॉइंट परख है और गतिज जानकारी प्रदान नहीं करता है। दूसरा, लक्ष्य कोशिकाओं को क्रोमियम-51 के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं से बाहर निकलजाती है और पृष्ठभूमि शोर22को काफी बढ़ा सकती है। अंत में, इसके लिए रेडियोधर्मी कचरे की उचित सावधानियां और निपटान की आवश्यकता होती है । वैकल्पिक परख, जो शक्ति के संकेत के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ कार टी-सेल इंटरैक्शन के उपउत्पादों को मापते हैं, में कार टी कोशिकाओं द्वारा जारी विभिन्न साइटोकिन्स की मात्रा शामिल है, जो या तो प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित तरीकों या एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरतुला परख का उपयोग करते हैं। एक बार फिर, ये एंडपॉइंट परख हैं जो एक निश्चित समय बिंदु पर साइटोकिन्स की संचयी रिहाई को मापते हैं और इस प्रकार, जरूरी नहीं कि कार टी कोशिकाओं की वास्तविक साइटोलिटिक गतिविधि को प्रतिबिंबित करें।
जब एक शक्ति परख विकसित, विशेष रूप से एक है कि एक सेल के लिए रिलीज मापदंड को परिभाषित करता है इस तरह के एक कार टी सेल के रूप में चिकित्सा आधारित है, यह महत्वपूर्ण है कि परख ंयूनतम जोड़तोड़ और हाथ पर समय शामिल है क्योंकि हर बातचीत एक और चर है कि के लिए जिंमेदार है और समग्र मजबूती और परख की निरंतरता कम कर सकते हैं । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कार टी कोशिकाओं की बातचीत एक गतिशील प्रक्रिया है, और इन गतिशील बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान करना, जैसे साइटोलिसिस की दर, शक्ति मूल्यांकन के लिए प्राथमिक महत्व का है। इन मानदंडों को ध्यान में रखते हुए, हमने कार टी कोशिकाओं के लिए एक लेबल-मुक्त गतिज शक्ति परख विकसित किया जो xCELLigence वास्तविक समय सेल विश्लेषण (RTCA) मंच का उपयोग करता है। xCELLigence विशेष माइक्रोटिटर प्लेटों (ई-प्लेट्स) का उपयोग करता है जिसमें प्रत्येक कुएं के नीचे में एम्बेडेड सोने के बायोसेंसर होते हैं। या तो अनुयायी ठोस ट्यूमर कोशिकाओं, या तरल कैंसर कोशिकाओं है कि विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सीमित किया गया है के साथ काम कर रहे, इन बायोसेंसर वास्तविक समय कार टी सेल में निगरानी लक्ष्य सेल संख्या, सेल आकार, सेल सब्सट्रेट लगाव शक्ति में परिवर्तन प्रेरित, और सेल सेल बातचीत (यानी बाधा समारोह)17,23,24,25,26,27,28। कार्यप्रवाह सरल है और इसमें लक्ष्य कोशिकाओं को ई-प्लेटों के कुओं में बोना शामिल है, जिसके बाद कार टी कोशिकाओं को विभिन्न प्रभावक-से-लक्ष्य अनुपात(चित्रा 1)पर जोड़ना शामिल है। बाद में, चूंकि बायोसेंसर लगातार लक्ष्य कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी करते हैं, डेटा स्वचालित रूप से वास्तविक समय में प्रदर्शित होता है।
पिछले 15 वर्षों में xCELLigence परख प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, कार टी कोशिकाओं, चेकपॉइंट अवरोधकों, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी, कैंसररोधी वायरस, और कुछ संयोजन चिकित्सा17,29,30,31,32,33,34की शक्ति का आकलन करने के लिए मान्य किया गया है। हाल ही में, xCELLigence शक्ति परख का मूल्यांकन टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) -इंजीनियर टी-सेल35के निर्माण के लिए किया गया था। यहां हम नैदानिक उपचारों में ठोस ट्यूमर और तरल ट्यूमर को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए आरटीसीए प्रणाली को नियोजित करने की रिपोर्ट करते हैं।
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स एक बाह्य एकल-श्रृंखला चर खंड (एससीएफवी क्षेत्र), एक काज क्षेत्र, एक ट्रांसम्मेब्रेन क्षेत्र, और टीसीआर सिग्नलिंग डोमेन से बना एक साइटोप्लाज्मिक डोमेन और सीडी 28 और OX4011,40जैसे रिसेप्टर्स से अतिरिक्त सहउत्तेजक डोमेन से बना मल्टीडोमेन प्रोटीन हैं। सुरक्षित, चयनात्मक और प्रभावोत्पादक सीएआर डिजाइन करने के लिए, यह जरूरी है कि सीएआर के डिजाइन में विभिन्न क्रमपरिवर्तनों को इन विट्रो शक्ति परखों और अंततः पशु मॉडल का उपयोग करके अच्छी तरह से परीक्षण किया जाए। इस अध्ययन में, हमने एक प्रोटोकॉल और कार्यप्रवाह प्रदान किया है कि कैसे एक वास्तविक समय में विट्रो शक्ति परख प्रभावोत्पादक सीएआरएस के डिजाइन को सूचित कर सकता है।
किसी भी प्रकार की शक्ति परख को डिजाइन करने में, विशेष रूप से विनिर्माण उद्देश्यों के लिए, यह जरूरी है कि परख संवेदनशील, मजबूत, सुसंगत हो, और संभव के रूप में कार्रवाई के तंत्र के करीबहो । वास्तविक समय शक्ति परख यहां वर्णित कार टी सेल की साइटोलिटिक गतिविधि को मापने के बजाय साइटोकिन रिलीज के रूप में एक किराए मार्कर का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । महत्वपूर्ण बात, परख के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए परख प्लेट (ई-प्लेट) और अनुशंसित मीडिया के अलावा अन्य रंगों या अभिकर्मकों जैसे किसी भी अतिरिक्त घटकों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, परख अति संवेदनशील है और अन्य लेबल आधारित परख42,43,44की तुलना में अत्यधिक प्रजनन योग्य डेटा प्रदान करता है। इसके अलावा, xCELLigence परख बहुत कम प्रभावक से लक्ष्य अनुपात का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है जो विशिष्ट साइटोलिसिस के मूल्यांकन के लिए आदर्श है।
xCELLigence प्रणाली के लचीलेपन और उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने दो ट्यूमर प्रकारों पर ध्यान केंद्रित किया है, अर्थात् हेमेटोलॉजिकल मूल और ठोस ट्यूमर के ट्यूमर। CD22-निर्देशित कार टी कोशिकाओं की शक्ति का आकलन करने के लिए, राजी कोशिकाओं (यानी, एक बी-सेल लिंफोमा सेल लाइन) को एंटी-सीडी40 एंटीबॉडी का उपयोग करके ई-प्लेटों में सीमित किया गया था। ई-प्लेटों के नीचे तक राजी कोशिकाओं के टेदरिंग के परिणामस्वरूप एक बाधा संकेत होता है जो कुएं में राजी कोशिकाओं की व्यवहार्यता और संख्या को दर्शाता है। सीडी 22-कार टी कोशिकाओं को जोडऩे के बाद, राजी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से एक समय और प्रभावक-निर्भर तरीके से मारा जाता है, जिसका समापन बाधा संकेत में समय-निर्भर कमी में होता है। बाधा में गिरावट साइटोलिसिस या राजी कोशिकाओं की व्यवहार्यता की हानि का प्रतीक है17। एंटीबॉडी का उपयोग करके इस चयनात्मक टेथरिंग दृष्टिकोण को अन्य तरल ट्यूमर सेल लाइनों तक बढ़ाया जा सकता है। हेमेटोलॉजिकल मूल की ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति अनुयायी कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करना है जो वाला कोशिकाओं में व्यक्त सीडी 19 जैसे ट्यूमर एंटीजन को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि माता-पिता वाला कोशिकाएं आसानी से उपलब्ध हैं और विशिष्टता के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग की जा सकती हैं। इस तरह के एक दृष्टिकोण पहले से ही चो-CD22 बनाम चो कोशिकाओं और चो-BCMAs बनाम चो कोशिकाओं29के साथ मान्य किया गया है । इस तरह के विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके, कार टी-सेल डिजाइन और प्रभावकारिता का आसानी से परीक्षण किया जा सकता है। xCELLigence परख स्वाभाविक रूप से लचीला है, और परख की स्थिति को अधिकतम लगभग शारीरिक स्थितियों के लिए समायोजित किया जा सकता है।
शक्ति परख हम यहां वर्णित का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह एक सरल कार्यात्मक परख है और आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक उच्च थ्रूपुट फैशन में इष्टतम और प्रभावोत्पादक CARs डिजाइन । जैसा कि ईजीएफआर-पॉजिटिव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई कार टी कोशिकाओं के लिए यहां दिखाया गया था, परख का उपयोग विभिन्न कार निर्माण/म्यूटेंट की सापेक्ष गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हमने दिखाया कि जब जीआईटीआर डोमेन सीडी 3 डोमेन के ऊपर स्थित होता है तो यह सीडी 3 डोमेन के डाउनस्ट्रीम स्थित होने की तुलना में अधिक मजबूत साइटोलिटिक गतिविधि दिखाता है।
यद्यपि यह वीवो कार टी सेल गतिविधि में पूरी तरह से सहसंबंधित नहीं है, इन विट्रो साइटोकिन रिलीज को ऐतिहासिक रूप से कार टी सेल शक्ति के उपाय के रूप में उपयोग किया गया है। हालांकि xCELLigence आधारित शक्ति परख यहां वर्णित सेल के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विनिर्माण के दौरान या नैदानिक आवेदन के लिए जारी किया जा रहा से पहले, कितनी अच्छी तरह इन परिणामों के साथ vivo प्रभावकारिता में सहसंबंधित अभी तक नहीं किया गया है स्थापित. वीवो प्रभावकारिता में कई कारकों और चरों पर निर्भर करता है जिन्हें इन विट्रो परख के भीतर पुनर्कापित नहीं किया जा सकता है। इस तरह के चर में शामिल हैं: ट्यूमर की साइट के लिए कार टी कोशिकाओं की होमिंग, उत्तेजना और कार टी सेल की सक्रियता और रोगी के भीतर जारी रखने की क्षमता, और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंटल । आगे शोधन के साथ xCELLigence परख इन जटिल प्रक्रियाओं में से कुछ मॉडलिंग में सक्षम हो सकता है ।
यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल सबसे अनुयायी कैंसर सेल लाइनों और तरल ट्यूमर सेल लाइनों में से कुछ पर लागू होता है । हालांकि, ट्यूमर प्रकारों और चरणों की जटिलता के कारण प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं जैसे नैदानिक नमूनों का आगे परीक्षण और अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। यह निश्चित रूप से ध्यान देने योग्य है कि इन विट्रो शक्ति परख प्रणाली यहां वर्णित कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करता है केवल कार टी कोशिकाओं की संभावित गतिविधि को प्रतिबिंबित करने के लायक है । मानव शरीर के अंदर असली ट्यूमर की स्थिति बहुत अधिक जटिल है, खासकर जब एक ठोस ट्यूमर को लक्षित किया जाता है, गतिशील ट्यूमर पर्यावरण और विकास के कारण। इसलिए, शक्ति मूल्यांकन परिणाम कार टी कोशिकाओं की नैदानिक प्रभावकारिता में बहुत अच्छी तरह से अनुवाद नहीं कर सकता है।
संक्षेप में, प्रस्तुत बाधा आधारित xCELLigence मंच समय की एक विस्तारित अवधि के लिए सेल हत्या की लेबल मुक्त निगरानी की अनुमति देता है, अर्थात् 10 दिनों तक । डेटा संग्रह के लिए इतने लंबे लौकिक पैमाने के लिए यह क्षमता अन्य परखों से प्रौद्योगिकी में अंतर करती है जो वर्तमान में उपयोग में हैं और जिन्हें समय बिंदु संग्रह और श्रमसाध्य नमूना हेरफेर के लिए कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतिस्थापित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रभावक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का न्यूनतम संकेत योगदान डेटा विश्लेषण को सरल बनाता है। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से डेटा को संसाधित कर सकता है और उपयोगी मापदंडों जैसे साइटोलिसिस, केटी50 आदि का प्रतिशत उत्पन्न कर सकता है। प्रौद्योगिकी पहले से ही उच्च संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है (ई के साथ: 1:20 के रूप में कम के रूप में टी अनुपात) और एक बड़ी गतिशील रेंज (ई: 20:1 से 1:20 अनुपात के साथ), जो आसानी से अंय assays के साथ प्राप्त नहीं है । कुल मिलाकर, इस तकनीक के कार्यान्वयन को उच्च थ्रूपुट पैमाने पर अधिक सटीक डेटा विश्लेषण की अनुमति देनी चाहिए जो कार टी-सेल एजेंटों के विकास को बढ़ाएगा, क्षेत्र को बहुत अधिक गति से आगे बढ़ाएगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए गए अभिकर्मकों और उपकरणों को प्रदान करने के लिए प्रोमाब बायोटेक्नोलॉजीज और एसीईए बायोसाइंसेज का धन्यवाद करते हैं।
7-AAD | Biolegend | 420404 | |
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit | ACEA Biosciences | 8100005 | |
anti-human F(ab')2 | Jackson Immunoresearch laboratories. | 109-116-088 | |
APC anti-CD3 | Biolegend | 317318 | |
Assay medium RPMI1640 | life technologies.Corp | 11875-093 | |
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 | Stemcell technologies | #07930 | |
CAR-T cell medium from ProMab | AIM-V+300IFU/ml IL-2 | 12055-091 | |
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads | Thermofisher | 11131D | |
DMEM | GElifesciences.com | SH30243.02 | |
FACS buffer | Promab made | ||
FBS | Lonza.com | 14-503F | |
HEK293FT | Thermo Fisher | R70007 | |
INFg ELISA kit | Thermo Fisher | ||
Lentiviral Packaging Mix | System Biosciences | VP100 | |
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) | Takara | 631235 | |
Promab medium for target cells | Varied with cell lines | ||
Real time Cellular Analyer | ACEA Biosciences | ||
Thermal cycler | Thermo Fisher | ||
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) | Transplus, Alstem | V020 | |
Transfection dilution solution, Opti-MEM | Thermo Fisher | ||
Transfection reagent, NanoFect reagent | Alstem | NF100 |