복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

Summary

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

Abstract

자연 유기 물질 (NOM) 역사적으로, 특성화 하기 어려운 증명 하는 유기 화합물의 수천의 매우 복잡 한 혼합물으로 구성 된다. 그러나, NOM의 분해에서 발생 하는 온실 가스 (이산화탄소 CO₂와 메탄 [채널₄]) 생산에 열역학 및 운동 제어, 이해 하는 분자 수준의 특성화와 결합 하 여 미생물 프로테옴 분석은 필요 합니다. 또한, 기후 및 환경 변화는 잠재적으로 유기 물 기판의 공급 및 변환을 수행 하는 미생물에 영향을 주는 복잡 한 상호 작용을 열 받은 자연 생태계를 교란 하 예상 된다. 유기 물, 미생물 proteomics, 경로 및 유기 물 분해 되는 변환의 상세한 분자 특성화 방향 및 환경 변화의 효과의 크기를 예측 하는 데 필요한 것입니다. 이 문서에서는 단일 샘플에서 포괄적인 대사 산물 특성화에 대 한 방법론 처리량 푸리에 변환 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS FTICR), 가스 크로마토그래피 질량 분석 (GC-MS)를 직접 주입 하 여 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (MS LC), 그리고 proteomics 분석. 이 방법은 유기 물질 분해, 결과 CO₂ 와 채널₄ 생산 속도, 그리고 환경 섭 동에 대 한 그들의 응답의 통로 유추에 대 한 통계 신뢰도 향상 완벽 하 게 결합 하 여 데이터 집합에서 발생 합니다. 여기 우리는 peatlands;에서 수집 된 NOM 샘플에이 메서드를 적용 한 결과 제시 그러나, 프로토콜 (예를 들어, 물, 숲된 토양, 해양 퇴적 물, 등) 어떤 NOM 샘플에 적용 됩니다.

Introduction

세계적으로, 습지 유기 C 토 탄 예금¹매장으로 주로 탄소 (C), 529 페이지 포함 견적 된다. 현재, 이러한 peatlands 북미 혼자¹29 Tg C y^-1 를 격리 그물 C 싱크 역할을 합니다. 그러나, 배수, 화재, 가뭄, 더 온난 한 온도 등 환경 장애 온실 가스를 통해 증가 C 손실의 결과로 유기 물 분해를 증가 시켜이 C 싱크를 상쇄 수 있습니다 (이산화탄소 [CO₂]와 [₄채널] 메탄) 생산^1,2. 기후 변화는 더 온난 한 온도 또는 건조 조건 빠른 C 분해 미생물에 의해 자극 하는 경우 C 감소에 기여할 수 있습니다. 또는, 높은 온도 및 공기 CO₂ 농도 유기 탄소 (OC는)로 더 많은 CO₂ 격리를 기본 생산을 자극 수 있습니다. OC CO₂ 로 분해 다음 어느 정도 하 고 얼마나 빨리와 채널₄ 는 전자 기증자 기판, 전자 수락자의 가용성 및 중재 미생물 사이 복잡 한 상호 작용에 따라 달라 집니다를 변환입니다. 대부분의 경우, 메커니즘은 잘 성격을 나타낸, 따라서 환경 섭 반응 잘 제한 된 이며 기후 변화의 결과 peatland 생태계에 탄소 균형에 있을 것입니다 불분명 남아.

자연 유기 물질 (NOM)의 복잡 한 자연도 역사적으로 어려운 다른 혼합물에 있는 유기 화합물을 식별 했다. 최근 발전 하는 전통적으로 화합물의 특성, 어느 정도 계속 완강히 humic 또는 fulvic 화합물^3,,45으로 간주, 우리의 능력 크게 향상. 우리는 지금 이러한 화합물의 많은 microbially 실제로 사용할 수 있으며 적당 한 터미널 전자 수락자 (차) 제공^6,7경우 분해 수 있습니다 이해 합니다. 화합물에 대 한 탄소 (NOSC)의 명목상 산화 상태 계산 분해 하 고 필요한 차 에너지 생산량에 대 한 가능성을 예측에 대 한 통계를 제공 합니다. 그러나, 그것은⁷유기 물질 분자 수준 특성을 요구 한다. NOSC는 분자 수식을 통해 다음 방정식⁷에서 계산: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, z 그물 충전이. NOSC 열역학 운전 힘⁸, 어떤 점에서 더 높은 NOSC와 화합물은 저하, 낮은 NOSC와 화합물 감소 하기 위해 점점 더 에너지 차와 필요로 쉽게 상관 된다. NOSC −2 보다는 더 적은으로 화합물 O₂, 질산염 또는 미네소타⁴, 같은 차를 양보 하는 높은 에너지를 필요로 하 고 일반적으로 발생 하 여 저하 될 수 없습니다 Fe^III 같은 차 들을 생성 하는 에너지를 낮은 또는 황산⁷. 이것은 O₂ 와 다른 고 에너지 차와 저조한는 부족⁹ 및 따라서 이러한 조건 하에서 낮은 NOSC 화합물의 저하는 습지에 물이 찼 네요 무산 소 조건에서 중요 한 고려 사항 열역학으로 제한. 환경 섭 동 O₂ (가장 정력적 인 전자 수락자), 유기 기판에 전자 수락자 사용할 수 변화에 영향을 주는 문학적 변화를 통해 생태계의 열역학적 상태에 영향을 미칠 수 있습니다 기본으로 생산, 및 온도 의해 더 작은 넓이에. Homoacetogenesis (즉, CO₂ 와 H₂에서 초 산 생산)와 hydrogenotrophic methanogenesis (사이 발생 하는 교환 관련 하 여 발생 하는 습지 시스템에서 온도 효과의 중요 한 예 즉, CO₂ 와 H₂에서 채널₄ 생산). 낮은 온도에서 그 homoacetogenesis는 약간 선호 따뜻한 온도 선호 채널₄ 생산¹⁰동안 나타납니다. 채널₄ 는 CO₂¹¹ 및 따라서 증가 생산의 비용에 채널₄ 의 보다 훨씬 더 강한 온실 가스가 온도 효과, 기후 변화 하는 생태계의 응답에 대 한 중요 한 암시를 할 수 있습니다. 따뜻한 온도에서 CO₂ 기후 온난화와 긍정적인 의견을 기여할 수 있습니다.

Peatlands CO₂ 의 세계적으로 중요 한 양을 생성 그리고 채널₄⁶을 통해 미생물의 호흡 유기 자연적 중요 합니다. 유기 탄소 기판의 NOSC CO₂의 상대적 비율 결정: 채널₄ 채널₄ 때문에 뿐만 아니라 CO₂¹¹에 비해 높은 복사 강제 때문에 중요 한 매개 변수는 생산 모델링 노력 peatlands¹²C 자 속 추정을 위한 중요 한 매개 변수로이 비율을 확인 했습니다. CO₂이외의 터미널 전자 수락자의 부재, 그것은 수 있다 표시 전자 균형에 의해 NOSC > 0 것 유기 C 기판 CO₂생산: 채널₄ > 1, NOSC 유기 C = 0 생성 CO₂ 와_{4 채널} < 1 아데닌의 비율, 그리고 NOSC 유기 C에서 CO₂를 생산할 예정 이다: 채널₄ < 1¹³. OC의 자연 생태계에서 분해 미생물, 중재는 그래서 그 경우에 특정 화합물의 열역학으로 가능, 운동 제한 무산 소 조건 하에서 그리고 미생물 효소의 활동으로 (즉, NOSC) 강제로 열역학 운전⁷. 지금까지 그것은 화합물 존재의 다양성 그들의 특성에 대 한 다른 보완 기술이 필요 하기 때문에 유기 물질을 완벽 하 게 특성을 도전 하고있다. 최근 발전 격차; 폐쇄 분석 기법에의 한 벌을 사용 하 여 우리가 유기 화합물 분자 수준 특성을 제공 하 고, 800 다 폴 리-heterocycles까지 포도 당 같은 작은 기본 대사 산물에서 어떤 경우 부 량에서 큰 범위를 분석할 수 있습니다. 이전 같은 큰 복잡 한 분자 것가지고 되었습니다 단순히으로 리그 닌 같은 또는 탄 닌 같은 특징 완강히 되었다고 가정. 그러나 분자 수준 특성,,도 이러한 큰 복잡 한 분자에 대 한 NOSC의 계산을 허용 한다. 이 NOSC 값은 선형 열역학 원동력의 유기 물 분해, 많은 경우에는 이러한 복잡 한 분자 microbially 수 실제로 있습니다 보여 사용할 수 있는 품질의 평가 대 한 수 있도록 연관 습지에 승리 무산 소 조건 에서도 분해.

O₂ 의 유기 물 분해를 거의 모든 자연 관찰 된 NOSC 값의 수, 이후 여기 우리가 변화에 포커스에서 유기 물질과 미생물 단백질 (즉, 습지에서 기본 드라이버를 될 것입니다. 제한 된 O₂) 시스템입니다. 그러나, 우리가 논의할 것 이다 모든 기법 모든 생태계에서 유기 물질에 적용할 수 있습니다. 일반적으로, 대량 측정 광학에 기반 하 고 형광 분석 유기 물질 품질^3,14을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나 이러한 대량 측정을 사용 하 여,, 세부 묘사가 손실 됩니다 분자의 많은 수는 함께 humics 또는 fulvics 같은 일반적인 용어 분류로. 이러한 범주 정의 잘 제한 된 그리고, 사실, 연구에서 연구 하 고 비교 불가능 한 다를 수 있습니다. 또한, 대량 측정 하지 시스템을 관리 하는 열역학 계산에 필요한 분자 정보 제공 고 따라서 진정으로 유기 물 품질¹⁵평가 짧은을.

푸리에 등 개별 기술 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS FTICR), 핵 자기 공명 (NMR) 분광학을 변형, 가스 착 색 인쇄기 질량 분 광 분석 (GC-MS), 그리고 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC-MS) 이러한 분자 수준의 정보를 제공 합니다. 이러한 기술을 각각 선물 자체의 한계, 하는 동안 그들은 또한는 분자 세부 엄격한 열역학적 의미에서 유기 물 품질 측정에 필요한 달성 하기 위해 통합된 된 접근 방식에 활용 될 수 있는 그들의 자신의 힘을가지고 . GC-MS는 CO₂ 와 채널₄ 생산 (예를 들면, 포도 당, 아세테이트, 등);에 근 영향을 미칠 가능성이 중요 한 작은 대사 산물을 식별 하는 데 유용 그러나, GC-MS 표준에 대 한 확인 필요 이며 따라서 소설 화합물을 방지 하는 데이터베이스에 있는 이미 알려진된 화합물으로 제한. 또한, GC-MS 상대적 농도 변화에 대 한 유추를 허용 하지만 예 Gibb의 자유 에너지 계산에 필요한 실제 농도 정보를 제공 하지 않는 세미 질적 기술입니다. 마지막으로, GC-MS 분석 화합물 ~ 400 다 보다 작은 해상도 제한 이전 분자의 derivatization 필요 하 고 휘발성 알코올 건조 단계 동안 손실 됩니다.

1 차원 (1d) ¹H 액체 상태 NMR 수 작은 대사 (포함 기본 작은 분자량 대사와 같은 알콜, 아세테이트, 아세톤, formate, pyruvate, 호박, 휘발성의 높은 양적 특성 짧은 체인 지방산 뿐만 아니라 탄수화물 악명 결 석 하 또는 MS 기반 방법에서 타협의 범위) 및 그들의 농도 특히 열역학 매개 변수를 계산 하는 데 유용. 그러나, GC-MS, 같은 복잡 한 혼합물의 1d NMR 데이터베이스를 기준으로 표준화를 요구 하 고 따라서 혼자 복잡 한 자연과 변화 생태계에서 풍부한 될 것 소설 화합물의 쉽게 식별을 허용 하지 않습니다. 또한 NMR은 MS 기반 기술을 보다 덜 민감한 따라서, NMR 시스템 헬륨 냉각 냉 프로브를 사용 하 여 1 µ M 이상만 달성은 양적 대사 산물 프로 파일링. 감사 합니다 널리 하지, 일부 NMR 냉 프로브 소금 관대 고 작은 직경 (< 3 m m 외부 직경) 튜브 샘플¹⁶에서 사용 될 때 millimolar 소금 농도의 환경 혼합물 분석을 허용 한다. 그러나, NMR의 더 합병증이 상자성 금속 및 무기물의 높은 금액 (예를 들어, Fe와 Mn, 고지대 토양에서 풍부한 수 1-3 wt %), 스펙트럼 기능을 확대 수 있습니다 그리고 복잡 하 게 NMR 스펙트럼의 해석 . 고체 상 추출 (SPE)를 사용 하 여 NMR과 MS 기반 metabolomics의 해석에서 보좌관 수 미네랄 소금 스펙트럼 품질 증가 여 방법.

직접 주입 하 여 FTICR MS 단일 샘플에서 대사 산물의 수천 수만 감지 능력이 매우 중요 한 기술 하지만 아세테이트, pyruvate, 호박 등 중요 한 작은 대사 산물을 캡처하지 않습니다 하 고 악명 높게 어렵다 설탕과 다른 탄수화물¹⁷에 대 한 사용 하 여도 그것은 정량적 인 정보를 제공지 않습니다. 그러나, 다른 기법과 달리 FTICR MS 식별 하 고 소설 화합물 분자 수식을 할당에서 능가 하 고 따라서 다른 설명 기법 보다 더 분자 정보를 제공 하는 화합물의 가장 큰 수를 식별 합니다. 특정 반응⁸ 및 특정 아래 그들의 비율의 가능성을 통치 열역학 원동력 관련 있는 NOSC 계산 하 FTICR MS (및 다른 기술)에 의해 제공 하는 분자 정보를 사용할 수 있습니다 때문에이 유용 조건⁷. 또한, 함께 협동 MS, LC 등 분리 기술로 FTICR MS를 연결 하 여 양적 구조 정보 수 있습니다 달성 될,이 기술의 단점 들을 상쇄. LC-MS 지질 같은 화합물과 다른 방법의 특징이 잘 하지 않은 다른 대사 산물을 식별 하는 데 유용 합니다. 일부 수집기와 구조 설명에 대 한 관심의 특정 신원 미상의 2 차원 (2D) 액체 상태 NMR은 식별 하 고 알 수 없는 화합물^{18 측정을 위한 이상적인 상황에 의해 수집 LC FTICR-MS 또는 LC MS 커플링 ,19}. 그러나,이 필요할 때 사용할 수 있는 매우 시간이 걸리는 단계입니다. 개별적으로 촬영, 이러한 기술의 각 유기 물질의 다른 스냅샷을 제공 하 고 그들을 통합 하 여 격리에서 기법 중 하나를 사용 하 여 보다 더 완벽 한 이해를 얻을 수 있습니다.

열역학 고려 사항에 어떤 변환 시스템에서 가능한 최고의 제약을 설정 하는 동안 유기 물 분해 미생물의 효소 활동 반응 속도 제어에 의해 중재 됩니다. 따라서, 미생물 효소 활동을 특성화 하는 통합된 omics 접근 필요 완벽 하 게 이해 하는 유기 물 분해 및 궁극적으로 습지에서 온실 가스 (CO₂ 와 채널₄) 생산에 컨트롤 뿐만 아니라 대사 산물입니다. 이 문서에서는, 우리 완전히 대응된 분석 결과 순차적 접근을 사용 하 여 단일 샘플에서 이러한 포괄적인 분석을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 대사 산물, 단백질, proteomics와 GC-MS LC MS²⁰ 작은 대사, 단백질 및 지질 대사 산물 양적 정보를 통합 하 여 식별 하 결합 했다 지질 추출 (MPLex) 프로토콜에 확장 통해 NMR 및 더 큰 2 차 대사 산물 을 통해 FTICR 양 약간 다른 MPLex의 식별, 우리 물 추출 그리고 점점 비 극 지 용 매로 사용 하 여 순차 추출와 프로토콜을 시작합니다. 모든 기사는 단일 샘플 볼륨 제한 또는 얻기 어려운 때 샘플을 보존 하 고 이기종 샘플 매트릭스 (예를 들면, 토양 및 토 탄)에서 aliquots 사이 변이 통해 소개 하는 실험적인 오류 감소에 완료 또는 보관 조건 및 기간에 차이입니다.

마지막으로, 미생물 커뮤니티의 proteomics 분석 옴 분석 커플링, 우리 통로 유기 물 분해의 변화를 설명 하는 대사 네트워크를 구축할 수 있습니다. 이것은 우리가 어떻게 섭 시스템에 영향을 미치는 궁극 CO₂ 와 변경 사용할 수 유기 기판, 전자 수락자, 미생물 커뮤니티를 통해 채널₄ 생산에 대 한 특정 가설을 테스트 하 반응을 통해 효소 촉매의 활동을 중재.

이 방법의 전반적인 목표 대사 산물, 지질, 및 분석 오류를 제한 하는 동안 대사 네트워크를 구축 하기 위한 완벽 하 게 짝된 데이터 집합 만드는 단일 샘플에서 미생물 단백질을 분석 하기 위한 단일 처리 프로토콜을 제공 하는 .

Protocol

1. 토양, 앙금, 또는 토 탄에서 유기 물질의 연속 추출 토양, 앙금, 또는 토 탄을 통해 유선 수집 하 고 (예를 들어, 깊이) 테스트 중인 가설에 따르면 코어 분할. 소계에 게 샘플 컨테이너 코팅 및 분석 전에 저장에 대 한-80 ℃에서 동결.참고: 약 25 mg C이이 프로토콜에 대 한 필요 합니다. 토 탄 (일반적으로 45 %C), 말린된 토 탄의 50 mg이 필요 합니다. 더 많은 양의 샘플 C에 따라 ?…

Representative Results

우리는 설명된 보완 분석 프로토콜을 수행 하 고 미네소타, 미국에서에서 가문비나무와 Peatlands 응답 아래 변경 환경 (가문비나무) 사이트에서 S1 수렁에 깊이 가진 토 탄을 비교. 이러한 결과 영구 동 토 층 늪지와 펜에서 사이트 대사 산물 및 효소 활동에 다를 수 있습니다 방법을 보여 북부 스웨덴에서 비교 됩니다. 우리는 proteomics 분석에 3,312 효소 발견. 깊이와 효소 활동의 분석 효소의 수 15 cm와…

Discussion

단일-처리량, 대사와는 프로테옴을 특성화 하는 데 사용 하는 완전히 결합 분석 스트림 경로 c 사이클에서 발생 하는 복잡 한 생태계에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 토양 및 토 탄은 이기종 행렬, 그리고 따라서,이 방법의 중요 한 단계 중 하나 시작 토 탄 또는 토양 물자는 높게 균질 성 확보에 초기 단계에서 발생 합니다. 그것은 뿐만 집계 추출 효율을 줄일 수 있습니다 샘플을 분쇄 하는 것이 좋?…

Materials

methoxyamine hydrochloride	Sigma Aldrich	226904	derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe	Bruker		instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)	Agilent	AG19091S-433	instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size)	ThermoFisher		instrumentation
2 mL glass vials	VWR International	46610-722	sample vials
autosampler vials	VWR International	97055-324; 9467671	sample vials
Chloroform	VWR International	JT9174-3	solvent
Ethanol	VWR International	BDH67002.400	solvent
methanol	VWR International	BDH85681.400	solvent
pyridine	VWR International	BDH67007.400	solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6	Sigma Aldrich	178837	standard
C8-C24 fatty acid methyl ester	Sigma Aldrich	CRM18918	standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide	Sigma Aldrich	24589-78-4	standard
Suwanee River Fulvic Acid standard	International Humic Substances Society	2S101F	standard
trimethylchlorosilane	Sigma Aldrich	89595	standard
Tuning Solution	Agilent
FTICR-MS analysis software	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS	Agilent	Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer	Varian Inova	Varian Direct Drive 600-MHz	NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR software
ultra-performance liquid chromatograph	waters	Aquity UPLC H	liquid chromatograph
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer	ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos	mass spectrometer