Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Summary

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Abstract

Matéria orgânica natural (NOM) é composta por uma mistura altamente complexa de milhares de compostos orgânicos que, historicamente, revelou-se difícil caracterizar. No entanto, para entender os termodinâmicos e cinéticos de controles na produção de gás (dióxido de carbono [CO₂] e [CH₄] de metano) com efeito de estufa resultantes da decomposição de NOM, uma caracterização do nível molecular juntamente com microbiana análises de Proteome é necessário. Além disso, clima e mudanças ambientais são esperadas para perturbar os ecossistemas naturais, potencialmente perturbador interações complexas que influenciam tanto o fornecimento de substratos matéria orgânica e microorganismos realizando as transformações. Uma detalhada caracterização molecular da matéria orgânica, proteomics microbiana e os caminhos e transformações pelo qual a matéria orgânica é decomposta será necessária prever a direção e a magnitude dos efeitos das mudanças ambientais. Este artigo descreve um throughput metodológica para caracterização do metabólito abrangente em uma única amostra por injeção direta de Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectrometria de massa de cromatografia gasosa (GC-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) e análise proteômica. Essa abordagem resulta em um conjunto de dados totalmente emparelhados que melhora a confiança estatística para inferir caminhos de decomposição de matéria orgânica, a resultante de CO₂ e taxas de produção de₄ CH e suas respostas a perturbação ambiental. Aqui apresentamos os resultados da aplicação deste método para NOM amostras coletadas de turfeiras; no entanto, o protocolo é aplicável para qualquer amostra NOM (por exemplo, turfa, solos florestais, sedimentos marinhos, etc.).

Introduction

Globalmente, as zonas húmidas são estima-se que contêm Pg 529 de carbono (C), principalmente como orgânico C enterrado em depósitos de turfa¹. Atualmente, tais turfeiras atuam como uma líquido C pia, sequestrando 29 Tg C y^-1 na América do Norte sozinho¹. No entanto, perturbações ambientais tais como drenagem, incêndios, seca e temperaturas mais quentes podem compensar esse coletor C, aumentando a decomposição de matéria orgânica, resultando em aumento C perdas através de gases de efeito estufa (dióxido de carbono [CO₂] e ^1,de produção metano [CH₄])². Mudança climática pode contribuir para a perda de C se temperaturas mais quentes ou secador condições estimulam mais rápido C decomposição por microorganismos. Alternativamente, umas mais altas temperaturas e concentrações no ar de CO₂ podem estimular a produção primária para sequestrar mais CO₂ como carbono orgânico (OC). Em que medida e rapidez que OC é então decomposta em CO₂ e CH₄ depende de interações complexas entre os substratos de doador de elétron, a disponibilidade de aceitadores de electrões e os microorganismos que medeiam a transformação. Em muitos casos, os mecanismos não são bem caracterizados, assim, sua resposta a perturbações ambientais não é bem restrita e ainda não está claro qual será o resultado da mudança climática no balanço de carbono em turfeiras ecossistemas.

A natureza complexa da matéria orgânica natural (NOM) tem feito mesmo identificando os compostos orgânicos presentes nas misturas NOM historicamente difícil. Avanços recentes têm melhorado muito nossa capacidade de caracterizar compostos que tradicionalmente e, em certa medida continuam a ser, considerado como recalcitrantes húmicos ou fúlvico compostos^3,4,5. Agora entendemos que muitos destes compostos são na verdade amostras disponíveis e podem ser decompostos se um aceptor de elétron terminal apropriado (TEA) feito disponível^6,7. Calcular o estado de oxidação nominal do carbono (NOSC) para um composto fornece uma métrica para predizer o potencial de decomposição e o rendimento energético do chá exigido. No entanto, requer uma caracterização do nível molecular da matéria orgânica⁷. NOSC é calculado a partir da fórmula molecular através da seguinte equação⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, onde z é a carga líquida. NOSC está correlacionada com a termodinâmica condução força⁸, em que compostos com maior NOSC são mais fáceis de degradar, enquanto compostos com menor NOSC exigem cada vez mais enérgicos chás para ser reduzido. Compostos com NOSC menos do que − 2 exigem uma alta energia produzindo chás como O₂, nitrato ou Mn^IVe não pode ser degradados por ocorrem comumente baixa energia produzindo chás como Fe^III ou sulfato de⁷. Esta é uma consideração importante nas condições anóxica alagadas encontrados em zonas húmidas onde O₂ e outra alta energia produzindo chás são escassos⁹ e, portanto, a degradação de compostos NOSC inferiores sob essas condições são termodinamicamente limitada. Perturbações ambientais podem influenciar o estado termodinâmico do ecossistema por mudanças hidrológicas que influenciam O₂ (o aceptor de elétron mais energético), alterações em substratos orgânicos e aceitadores de electrões disponibilizados pela primária produção e em menor grau pela temperatura. Um exemplo importante dos efeitos da temperatura em sistemas de zonas húmidas ocorre no que diz respeito a troca que ocorre entre homoacetogenesis (ou seja, produção de acetato de CO₂ e H₂) e hydrogenotrophic metanogênese ( ou seja, produção de₄ CH de CO₂ e H₂). A baixas temperaturas, parece que esse homoacetogenesis é ligeiramente favorecida, enquanto temperaturas mais quentes favorecem CH₄ produção¹⁰. Este efeito da temperatura pode ter implicações importantes para a resposta dos ecossistemas às mudanças climáticas, como CH₄ é um gás de efeito estufa muito mais forte do que o CO₂¹¹ e, consequentemente, aumento da produção de CH₄ , às custas de CO₂ em temperaturas mais quentes podem contribuir para um feedback positivo com aquecimento climático.

Turfeiras produzem globalmente significativas quantidades de CO₂ e CH₄⁶via microbiana respiração de ocorrência natural orgânico importa. O NOSC de substratos orgânicos carbono determina a proporção relativa de CO₂: CH₄ produzido que é um parâmetro crítico devido a força radioativa maior de CH₄ comparado com CO₂¹¹, mas também porque esforços de modelagem identificaram esta relação como um parâmetro crítico para estimar o fluxo de C em turfeiras¹². Na ausência de aceitadores de electrões terminal diferente de CO₂, pode ser mostrado pelo saldo de elétron que os substratos orgânicos C com vontade de > 0 NOSC produzem CO₂: CH₄ > 1, C orgânico com NOSC = 0 produz CO₂ e CH₄ em proporção equimolar e C orgânico com NOSC < 1 produzirá CO₂: CH₄ < 1¹³. Decomposição de OC em ecossistemas naturais é mediada por microorganismos, para que mesmo quando a degradação de um composto específico é termodinamicamente possível, é cineticamente limitada pela atividade de enzimas microbianas e, sob condições anóxica, pelo termodinâmico força (ou seja, NOSC)⁷. Até agora tem sido desafiador para caracterizar plenamente a matéria orgânica, porque a diversidade de compostos presentes requer diferentes técnicas complementares para a sua caracterização. Recentes avanços tem fechado o intervalo; utilizando um conjunto de técnicas analíticas podemos analisar uma grande variedade de compostos orgânicos, proporcionando a caracterização molecular-nível e, em alguns quantificação de casos, de pequenos metabolitos primários como glicose até 800 Da poli-heterocíclicos. Anteriormente tais moléculas grandes e complexas que foram caracterizadas simplesmente como lignina como ou como tanino e assumiu ter sido recalcitrantes. Caracterização molecular-nível, no entanto, permite o cálculo do NOSC mesmo essas grandes moléculas complexas. Esses valores NOSC são linearmente correlacionadas com a força motriz termodinâmica, permitindo uma avaliação da qualidade da matéria orgânica disponível para a decomposição, que, em muitos casos, revela que estas moléculas complexas podem ser bacteriana degradável, mesmo sob as condições anóxica que prevalecem nas zonas húmidas.

Desde que a introdução de O₂ permite que a matéria orgânica de quase todos os valores NOSC naturalmente observados para ser decomposto, neste documento, focamos em mudanças na matéria orgânica e proteomics microbiana que possam ser os drivers primários no Pantanal (i.e., sistemas de limitado O₂). No entanto, todas as técnicas que iremos discutir podem ser aplicadas a matéria orgânica de qualquer ecossistema. Comumente, medições em massa com base em óptica e análises de fluorescência têm sido utilizadas para avaliar a qualidade de matéria orgânica^3,14. Quando usando medições em massa tais como estes, no entanto, detalhes são perdidos como um grande número de moléculas é categorizado juntos em termos genéricos, como humics ou fulvics. As definições destas categorias não são bem restrita e, na verdade, podem variar de estudo para estudo fazendo comparações impossíveis. Além disso, medidas em massa não fornecem os detalhes moleculares necessários para o cálculo da termodinâmica que regem o sistema e aquém, portanto, verdadeiramente, avaliação de qualidade de matéria orgânica¹⁵.

Técnicas individuais como Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), cromatografia gasosa (GC-MS) de espectrometria de massa, e fazer de espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) fornece tais detalhes no nível molecular. Enquanto cada uma dessas técnicas apresenta suas próprias limitações, eles também trazem suas próprias forças que podem ser aproveitadas em uma abordagem integrada para alcançar os detalhes moleculares necessários para quantificar a qualidade da matéria orgânica em um rigoroso sentido termodinâmico . GC-MS é útil para a identificação de metabolitos pequenos críticos que são susceptíveis de ter influência proximal em CO₂ e a produção de₄ CH (por exemplo, glicose, acetato, etc.); no entanto, GC-MS requer verificação contra um padrão e, portanto, é limitada aos já conhecidos compostos presentes no banco de dados impedindo a identificação de novos compostos. Além disso, GC-MS é uma técnica qualitativa semi permitindo inferência sobre as alterações na concentração relativa, mas não fornecendo as informações reais de concentração necessárias para calcular as energias livres de Gibb, por exemplo. Finalmente, GC-MS exige derivatização de moléculas antes da análise, que limita a resolução menor do que o Da ~ 400 compostos e álcoois voláteis são perdidos durante a etapa de secagem.

Unidimensional (1D) ¹H estado líquido NMR permite a caracterização altamente quantitativa de metabólitos pequenas (incluindo metabolitos primários peso molecular pequeno e voláteis como álcoois, acetato, acetona, formiato, piruvato, ácido succínico, ácidos graxos de cadeia curta, bem como uma variedade de carboidratos notoriamente ausentes ou comprometidos de métodos baseados em MS) e suas concentrações são particularmente úteis para cálculo dos parâmetros termodinâmicos. Ainda, como GC-MS, 1D NMR de misturas complexas requer padronização em relação a um banco de dados e, portanto, sozinho não permite a fácil identificação de novos compostos que são susceptíveis de ser abundante em complexos ecossistemas naturais e em constante mudanças. Além disso, NMR é menos sensível do que as técnicas baseadas em MS e, portanto, de perfil quantitativo metabólito é conseguida apenas acima de 1 µM, usando sistemas de NMR equipados com hélio-refrigeração frio-sondas. Não muito apreciado, algum frio NMR-sondas são sal-tolerante e permitam análise ambiental mistura na presença de concentrações milimolar de sal quando usado em menor diâmetro (diâmetro exterior de < 3 mm) tubos de amostra¹⁶. No entanto, uma outra complicação de NMR é que quantidades elevadas de paramagnéticos metais e minerais (por exemplo, Fe e Mn acima de 1-3 wt %), que pode ser abundante em solos de terra firme, pode ampliar características espectrais e complicar a interpretação dos espectros NMR . Usando a extração de fase sólida (SPE) pode auxiliar na interpretação de NMR e baseados em MS metabolomics métodos reduzindo os sais minerais e aumentando a qualidade espectral.

FTICR-MS por injecção directa é uma técnica altamente sensível capaz de detectar a dezenas de milhares de metabólitos de uma única amostra, mas não captura os metabolitos pequenos críticos como acetato, piruvato e succinato e é notoriamente difícil de Use para açúcares e outros carboidratos¹⁷, nem fornecer informações quantitativas. No entanto, ao contrário de outras técnicas, FTICR-MS é excelente em identificar e atribuir a fórmula molecular de novos compostos e, portanto, identifica o maior número de compostos, fornecendo informações moleculares mais do que qualquer das outras técnicas descritas. Isso é útil, porque a informação molecular fornecida pelo FTICR-MS (e outras técnicas) pode ser usada para calcular NOSC que está relacionada com a força motriz termodinâmica que regem a probabilidade de certas reações⁸ e suas tarifas em certas condições⁷. Além disso, pelo acoplamento FTICR-MS com técnicas de separação, tais como LC juntamente com tandem MS, informações quantitativas estruturais podem ser alcançadas, compensando algumas das desvantagens desta técnica. LC-MS é útil para identificar compostos lipídicos, como e outros metabolitos que não são bem caracterizados por qualquer um dos outros métodos. Acoplamento FTICR de LC-MS ou LC-MS com um coletor de fração e coletando frações de incógnitas específicas de interesse para a elucidação estrutural por estado de líquido bidimensional (2D) NMR é a situação ideal para identificação e quantificação dos compostos desconhecidos^{18 ,19}. No entanto, este é um passo muito demorado que poderia ser usado se e quando necessário. Tomadas individualmente, cada uma dessas técnicas fornecem um instantâneo diferente da matéria orgânica, e integrando-os, nós pode alcançar uma compreensão mais completa do que usando qualquer uma das técnicas isoladamente.

Enquanto as considerações termodinâmicas definir as restrições de finais sobre quais transformações são possíveis em um sistema, decomposição de matéria orgânica é mediada por microorganismos cujas actividades enzimáticas controlam taxas de reação. Assim, entender completamente os controles na decomposição de matéria orgânica e, finalmente, a produção de gás (CO₂ e CH₄) estufa de zonas húmidas exige uma abordagem integrada omics para caracterizar as atividades da enzima microbiana, bem como os metabólitos. Neste artigo, descrevemos um método para a realização de uma análise abrangente de uma única amostra, utilizando uma abordagem sequencial que resulta em uma análise totalmente emparelhada. Esta abordagem expande o metabolito, proteína e protocolo de extração (mplexas) de lipídios na qual proteomics foi acoplado com GC-MS e LC-MS²⁰ para identificar pequenos metabólitos, proteínas e lipídios, incorporando informações quantitativas metabólito através NMR e identificação dos maiores metabólitos secundários através de FTICR-Sra. ligeiramente diferente do mplexas, começamos o protocolo com uma extração de água e depois uso sequencial extração com solventes não-polares cada vez mais. Todas as extrações são feitas em uma única amostra que conserva a amostra quando volumes são limitados ou difíceis de obter e diminui o erro experimental introduzido através da variação entre alíquotas de matrizes de amostra heterogênea (por exemplo, o solo e turfa) ou diferenças nas condições de armazenamento e duração.

Finalmente, pelo acoplamento das análises de OM com proteomics análises da comunidade microbiana, podemos construir redes metabólicas que descrevem os caminhos e a transformação da decomposição de matéria orgânica. Isto permite-nos testar hipóteses específicas sobre como as perturbações ao sistema influenciará final de CO₂ e a produção de₄ CH através de alteração para os substratos orgânicos disponíveis, aceitadores de electrões e as comunidades microbianas mediando as reações através da atividade de catalisadores de enzima.

O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo único de taxa de transferência para a análise de metabólitos, lipídios e proteínas microbianas de uma única amostra, criando um conjunto de dados totalmente pareado para a construção de redes metabólicas enquanto erros analíticos a restrição .

Protocol

1. sequencial extração de matéria orgânica do solo, sedimentos ou turfa Coletar o solo, sedimentos ou turfa através do dielétrico e dividir os núcleos de acordo com a hipótese que está sendo testado (por exemplo, profundidade). Loja de amostras em politetrafluoretileno revestido recipientes e congelam a-80 ° C para armazenamento antes da análise.Nota: Aproximadamente 25 mg C é necessária para este protocolo. Para turfa (normalmente 45% C), 50 mg de turfa seca é necessária. M…

Representative Results

Realizamos o protocolo descrito análise complementar e comparado a turfa com profundidade no pântano S1 no site Spruce e turfeiras resposta sob mudando ambientes (SPRUCE) em Minnesota, EUA. Estes resultados são comparados aos de um pântano de permafrost e fen do norte da Suécia, para mostrar como sites podem variar em atividades metabólito e enzima. Nós identificamos 3.312 enzimas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimas com profundidade revela que o número de enzimas declina acentuadamente en…

Discussion

O single-produção, fluxo de análise totalmente acoplados usado para caracterizar metabólitos e o proteome fornece insights sobre os caminhos pelos qual C ciclismo está ocorrendo em um complexo ecossistema. Solo e a turfa são matrizes heterogêneas, e, portanto, uma das etapas críticas desse método ocorre nos primeiros passos no sentido de garantir que a partida de turfa ou material de solo é altamente homogênea. É preferível moer a amostra, bem como agregados podem reduzir a eficiência de extração. Este é…

Materials

methoxyamine hydrochloride	Sigma Aldrich	226904	derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe	Bruker		instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)	Agilent	AG19091S-433	instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size)	ThermoFisher		instrumentation
2 mL glass vials	VWR International	46610-722	sample vials
autosampler vials	VWR International	97055-324; 9467671	sample vials
Chloroform	VWR International	JT9174-3	solvent
Ethanol	VWR International	BDH67002.400	solvent
methanol	VWR International	BDH85681.400	solvent
pyridine	VWR International	BDH67007.400	solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6	Sigma Aldrich	178837	standard
C8-C24 fatty acid methyl ester	Sigma Aldrich	CRM18918	standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide	Sigma Aldrich	24589-78-4	standard
Suwanee River Fulvic Acid standard	International Humic Substances Society	2S101F	standard
trimethylchlorosilane	Sigma Aldrich	89595	standard
Tuning Solution	Agilent
FTICR-MS analysis software	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS	Agilent	Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer	Varian Inova	Varian Direct Drive 600-MHz	NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR software
ultra-performance liquid chromatograph	waters	Aquity UPLC H	liquid chromatograph
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer	ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos	mass spectrometer