इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य के लिए लेबल, समृद्ध है, और एक जटिल जैविक नमूना से प्रोटीन कळेनासे CK2 के substrates की पहचान ऐसे एक सेल lysate या ऊतक homogenate के रूप में । इस विधि इस प्रयोजन के लिए CK2 जीव विज्ञान के अद्वितीय पहलुओं का लाभ उठाता है ।
काइनेज-सब्सट्रेट संबंधों के अध्ययन के लिए इन एंजाइमों और दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में उनके बहाव के लक्ष्य के कार्यों की एक पूरी समझ हासिल करने के लिए आवश्यक है । CK2 कई सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल substrates के सैकड़ों की बढ़ती सूची के साथ एक विकासवादी संरक्षित सेरीन/threonine कळेनासे है । इसकी अधिकता गुण के कारण, की पहचान करने और CK2 substrates के एक व्यापक सेट की विशेषता विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है और इस महत्वपूर्ण एंजाइम के अध्ययन में एक बाधा बनी हुई है. इस चुनौती को संबोधित करने के लिए, हम एक बहुमुखी प्रयोगात्मक रणनीति है कि लक्षित संवर्धन और ख्यात CK2 substrates की पहचान के लिए सक्षम बनाता है तैयार किया है । यह प्रोटोकॉल अद्वितीय दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता का लाभ लेता है CK2 की विशिष्ट थियोफॉस्फोरेलेशन के लिए अनुमति देता है एक सेल या ऊतक lysate में इसके substrate. इन सब्सट्रेट प्रोटीन बाद में alkylated हैं, immunoprecipitated, और तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा की पहचान की/अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms/ हम पहले इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक drosophila अंडाशय से CK2 substrates की पहचान करने के लिए और यहां हम मानव ग्लोब्लास्टोमा कोशिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन का विस्तार, इस विधि की जांच करने के लिए ग्राह्यता illustrating विभिन्न मॉडल जीवों और प्रायोगिक प्रणालियों में इस काइनेज की जैविक भूमिकाएं ।
प्रोटीन kinases संकेत पारक्रमण cascades के प्रमुख घटक हैं । इन एंजाइमों द्वारा सब्सट्रेट प्रोटीन के फॉलिसिलेशन जैविक प्रतिक्रियाएं जो कोशिका विभाजन, चयापचय, और भेदभाव को नियंत्रित करने वाली महत्वपूर्ण घटनाओं को विनियमित करती हैं, दूसरों के बीच । CK2 एक बैरा व्यक्त किया है, acidophilic serine/threonine कळेनासे कि खमीर से मनुष्यों के लिए संरक्षित है और है कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है transcriptional विनियमन से सेल चक्र प्रगति करने के लिए apoptosis1 ,2,3. एंजाइम दो उत्प्रेरक α (या α ‘) उपयूनिटों और दो नियामक β उपयूनिटों4से बना विषमयुग्मक है । अत्यधिक pleiotropic होने के अलावा, CK2 दो अंय असामांय विशेषताओं है कि इसके विश्लेषण, अर्थात् संवैधानिक गतिविधि5 और दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता6प्रदर्शित करता है । इस उत्तरार्द्ध संपत्ति को gtp का उपयोग करने की क्षमता के साथ CK2 endows के रूप में अच्छी तरह से सब्सट्रेट प्रोटीन के फास्फालिलेशन के लिए एटीपी.
CK2 के उत्प्रेरक या विनियामक उपइकाइयों के आनुवंशिक विलोपन में चूहों में परिणाम भ्रूण lethality का संकेत है कि यह विकास और ऑर्गेनोजेनेसिस7,8के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । CK2 भी कैंसर के कई प्रकार में overexpressed है और इस प्रकार एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य9,10,11का प्रतिनिधित्व करता है । दरअसल, CK2 कळेनासे गतिविधि को लक्षित करने वाले विशिष्ट अवरोधक इस प्रयोजन के लिए वर्तमान में जांच कर रहे हैं12,13,14. जबकि CK2 के निषेध एक व्यवहार्य विकल्प है, उसके बहुप्रभावी प्रकृति, एक विकल्प और शायद अधिक तर्कसंगत दृष्टिकोण को देखते हुए महत्वपूर्ण CK2 substrates कि कुछ कैंसर की प्रगति आबाद लक्ष्य होगा । इसलिए, व्यापक पहचान और CK2 सब्सट्रेट प्रोटीन के लक्षण वर्णन विशिष्ट समारोह (ओं) एक विशेष ऊतक या ट्यूमर प्रकार के भीतर इस कळेनासे के elucidating के लिए महत्वपूर्ण लाभ का होगा ।
यहां, हम एक जटिल जैविक नमूने से एक सेल या ऊतक lysate के रूप में CK2 substrates की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी जैव रासायनिक विधि का वर्णन । यह प्रोटोकॉल gtp एनालॉग gtpγs (ग्वानोसिन 5 ‘-[γ-thio] ट्राइफॉस्फेट) के उपयोग द्वारा CK2 की दोहरी सह-सब्सट्रेट विशिष्टता का लाभ उठाता है, जो अन्य अंतर्जात kinases का उपयोग नहीं कर सकता । यह प्रभावी ढंग से करने के लिए कळेनासे “लेबल” इसके बाद अलगाव और पहचान के लिए इस नमूने के भीतर substrates की अनुमति देता है ।
यहां, हम एक जटिल जैविक नमूना से प्रोटीन कळेनासे CK2 की पहचान करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल जैव रासायनिक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम असामान्य एंजाइमी गुणों पर आधारित हैं CK2 और gtpγS का उप…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के हिस्से में एक राष्ट्रमंडल यूनिवर्सल अनुसंधान के स्वास्थ्य के पेनसिल्वेनिया विभाग से वृद्धि अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था t.i.s.
12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |