Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil
Summary
O objetivo do presente protocolo é rotular, enriquecer e identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa como um lisado celular ou homogeneizado de tecido. Este método utiliza aspectos únicos da biologia CK2 para essa finalidade.
Abstract
O estudo das relações de quinase-substrato é essencial para uma compreensão completa das funções de enzimas e suas metas a jusante em Estados fisiológicos e patológicos. CK2 é uma quinase serina/treonina evolutivamente conservada com uma lista crescente de centenas de substratos envolvidos em vários processos celulares. Devido a suas propriedades pleiotrópicos, identificando e caracterizando um conjunto abrangente de substratos CK2 tem sido particularmente desafiador e continua a ser um obstáculo no estudo desta importante enzima. Para responder a este desafio, criámos uma estratégia experimental versátil que permite o enriquecimento de alvo e identificação de substratos de CK2 putativos. Este protocolo aproveita a único dual co especificidade de CK2 permitindo lisado thiophosphorylation específica de seus substratos em uma célula ou tecido. Estas proteínas de substrato são posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS). Temos anteriormente usado essa abordagem para identificar com sucesso CK2 substratos de Drosophila ovários e aqui nós estendemos a aplicação do presente protocolo para células de glioblastoma humano, ilustrando a capacidade de adaptação desse método para investigar a papéis biológicos deste quinase em vários organismos modelo e sistemas experimentais.
Introduction
Quinase de proteína é componentes-chave de cascatas de transdução de sinal. Fosforilação de proteínas de substrato por estas enzimas elicia respostas biológicas que regulam eventos críticos, controlando a divisão celular, metabolismo e diferenciação, entre outros. CK2 é uma quinase serina/treonina ubiquitously expressa, acidófilo que é conservada do fermento aos seres humanos e que tem um papel importante em muitos processos celulares, variando de regulamento transcriptional a progressão do ciclo celular a apoptose1 ,2,3. A enzima é uma heterotetramer composta por dois α catalítico (ou α’) subunidades e dois de subunidades reguladoras β4. Além de ser altamente pleiotrópicos, CK2 exibe dois outras incomuns características que complicam a sua análise, ou seja, atividade constitutiva5 e especificidade de substrato co dupla6. Esta última Propriedade dota CK2 com a capacidade de usar o GTP, bem como ATP por fosforilação de proteínas de substrato.
Exclusão genética das subunidades catalíticas ou regulamentares da CK2 em camundongos resulta em embrionária letalidade indicando que ele tem um papel crucial durante o desenvolvimento e organogênese7,8. CK2 também é overexpressed em vários tipos de câncer e, portanto, representa um promissor alvo terapêutico9,10,11. Com efeito, inibidores específicos dessa atividade de quinase CK2 alvo estão atualmente sob investigação por este propósito12,13,14. Enquanto a inibição da CK2 é uma opção viável, dada a sua natureza pleiotrópicos, alternativa e talvez a abordagem mais racional seria alvo de substratos CK2 críticos que sustentam a progressão de certos tipos de câncer. Portanto, o abrangente identificação e caracterização das proteínas de substrato CK2 seria um benefício significativo para elucidar as funções específicas deste quinase dentro de um determinado tipo de tecido ou tumor.
Aqui, descrevemos um método bioquímico versátil para identificar substratos CK2 de uma amostra biológica complexa como uma célula ou tecido lisado. Este protocolo aproveita a especificidade de substrato co dual de CK2 pelo uso do análogo de GTP GTPγS (guanosina 5′-[γ-thio]triphosphate) que não podem usar outras cinases endógenas. Efetivamente, isso permite que a quinase de “rotular” seus substratos dentro desta amostra para posterior isolamento e identificação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um método relativamente simples e bioquímico para identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa. Os passos críticos do presente protocolo são baseados nas propriedades enzimáticas incomuns de CK2 e incluem thiophosphorylation CK2 dependente das proteínas de substrato específico usando GTPγS e sua subsequente imunoprecipitação e identificação. Com estes resultados, nós Demonstramos a utilidade e versatilidade desta abordagem como temos agora apli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por uma subvenção da Comunidade Universal do realce de pesquisa do departamento da saúde de Pensilvânia para T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
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