Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod
Summary
Syftet med detta protokoll är att märka, berika och identifiera substrat av proteinkinas CK2 från en komplexa biologiska prov som en cell lysate eller vävnad Homogenatet. Denna metod utnyttjar unika aspekter av CK2 biologi för detta ändamål.
Abstract
Studien av Kreatinkinas-substrat relationer är avgörande för att få en komplett förståelse för funktionerna hos dessa enzymer och deras nedströms mål i både fysiologiska och patologiska stater. CK2 är en evolutionärt bevarade serin/treonin-Kinas med en växande lista av hundratals substrat inblandade i flera cellulära processer. På grund av dess pleiotropiska egenskaper, att identifiera och karaktärisera en omfattande uppsättning CK2 substrat har varit särskilt utmanande och förblir ett hinder i studien av detta viktiga enzym. För att möta denna utmaning, har vi utarbetat en mångsidig experimentella strategi som möjliggör riktade anrikning och identifiering av förmodad CK2 substrat. Detta protokoll utnyttjar unika dubbla samtidig substrat specificitet CK2 möjliggör specifika thiophosphorylation av dess substrat i en cell eller vävnad lysate. Dessa substrat proteiner är därefter alkylerade, immunoprecipitated, och identifieras av liquid chromatography/tandem masspektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidigare använt denna metod att framgångsrikt identifiera CK2 substrat från Drosophila äggstockarna och här vi utsträcka tillämpningen av detta protokoll till mänskliga glioblastoma celler, som illustrerar anpassningsförmåga med denna metod att undersöka den biologiska roller här Kinas i olika modellorganismer och experimentella system.
Introduction
Proteinkinaser är nyckelkomponenter för signaltransduktion cascades. Fosforylering av substrat proteiner av dessa enzymer framkallar biologiska svar som reglerar kritiska händelser kontrollerar celldelning, ämnesomsättning och differentiering, bland andra. CK2 är en ubiquitously uttryckt, acidofiler serin/treonin-Kinas som är bevarad från jäst till människor och som spelar viktiga roller i många cellulära processer alltifrån Transkriptionsreglering till cellcykelns förlopp till apoptos1 ,2,3. Enzymet är en heterotetramer består av två katalytisk α (eller α’) subenheter och två reglerande β-subenheter4. Förutom att vara mycket pleiotropiska, uppvisar CK2 två andra ovanliga egenskaper som komplicerar dess analys, nämligen konstituerande verksamhet5 och dubbla samtidig substrat specificitet6. Detta sistnämnda Boende begåvar CK2 med möjlighet att använda GTP samt ATP för fosforylering av substrat proteiner.
Genetiska radering av katalytisk eller reglerande subunitsna av CK2 hos möss resulterar i embryonal dödlighet som anger att det spelar avgörande roller under utveckling och organogenes7,8. CK2 förekommer också i ökad utsträckning i flera typer av cancer och utgör därmed en lovande terapeutiskt mål9,10,11. Hämmare som målaktiviteten CK2 Kreatinkinas är faktiskt för närvarande under utredning för detta ändamål12,13,14. Medan hämning av CK2 är ett genomförbart alternativ, med tanke på dess pleiotropiska natur, ett alternativ och kanske mer rationellt tillvägagångssätt skulle vara att rikta kritiska CK2 substrat som ligger bakom utvecklingen av vissa cancerformer. Därför, omfattande identifiering och karakterisering av CK2 substrat proteiner skulle vara till stor nytta för belysa specifika funktionerna här Kinas inom en viss typ av vävnad eller tumör.
Här beskriver vi en mångsidig biokemisk metod för att identifiera CK2 substrat från komplexa biologiska prov som en cell eller vävnad lysate. Detta protokoll utnyttjar dubbla samtidig substrat specificitet CK2 genom användning av det GTP analogt GTPγS (guanosin 5′-[γ-thio]triphosphate) som andra endogena kinaser inte kan använda. Detta tillåter effektivt den Kinas att ”märka” dess substrat inom detta prov för efterföljande isolering och identifiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en relativt enkel biokemiska metod för att identifiera substrat av proteinkinas CK2 från ett komplext biologiskt prov. De kritiska steg i detta protokoll baseras på CK2 ovanliga enzymatisk egenskaper och inkluderar CK2-beroende thiophosphorylation av särskilda substrat proteiner använder GTPγS och deras efterföljande immunoprecipitation och identifiering. Med dessa resultat, har vi visat nytta och mångsidigheten hos denna strategi som vi nu har tillämpat denna strategi i både mänskli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av Commonwealth Universal forskning Enhancement bidrag från Pennsylvania hälsodepartementet till T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Recherche en cancérologie. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
