שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה
Summary
אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.
Abstract
חלבונים הן חברות הסלולר העיקרי של מערכות ביולוגיות, הם בדרך כלל לקיים אינטראקציה עם אחרים מאקרו או מולקולות קטנות כדי לבצע תפקודים ביולוגיים שלהם. אינטראקציות כזה יכול להיות מאוד דינמיים, כלומר subunits שמעצבת כל הזמן משויך, חלופה מועדפת בשיעורים מסוימים. בעוד מדידה של זיקה מחייבת שימוש בטכניקות כגון הנפתח כמותיים חושף את עוצמת האינטראקציה, לומד את קינטיקה איגוד מספק תובנות על איך מהר האינטראקציה מתרחשת, כמה זמן כל מתחם יכולה להתקיים. יתר על כן, מדידה של קינטיקה של אינטראקציה בנוכחות גורם נוסף, כגון פקטור המרת חלבון או סם, מסייע לחשוף את המנגנון שבאמצעותו האינטראקציה מוסדר על ידי הגורם השני, מתן ידע חשוב עבור קידום מחקר ביולוגי ורפואי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול למדידת קינטיקה של איגוד של קומפלקס החלבונים יש שיעור גבוה האגודה מהותי, יכול להיות חלופה מועדפת במהירות על ידי חלבון אחר. השיטה משתמשת העברת אנרגיה של קרינה פלואורסצנטית תהודה לדווח היווצרות של המתחם חלבון במבחנה, והוא מאפשר ניטור של דיסוציאציה של המתחם בזמן אמת על fluorimeter זרימה הפסיק וארגון מהר. שימוש assay הזה, הם לכמת את קבועי קצב דיסוציאציה וארגון של החלבונים.
Introduction
פעילויות ביולוגיות בסופו של דבר תבוצענה על ידי חלבונים, ביותר אשר אינטראקציה עם אחרים עבור תפקודים ביולוגיים נאותה. שימוש בגישה חישובית, הסכום הכולל של אינטראקציות חלבון-אנוש מוערך ~ 650,0001, שיבוש אינטראקציות אלה לעיתים קרובות מוביל מחלות2. עקב תפקידיהם חיוני בשליטה הסלולר תהליכים organismal, פותחו שיטות רבות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון, כגון שמרים-שני-היברידית, קומפלמנטציה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית, פיצול-לוציפראז קומפלמנטציה ו- co-immunoprecipitation assay3. בעוד ששיטות אלה טובים גילוי ולאשר אינטראקציות חלבון-חלבון, הם בדרך כלל שאינם כמותיים, ובכך לספק מידע מוגבל לגבי הזיקה בין בני הזוג חלבון אינטראקציה. השפעה כמותית-דאונס יכול לשמש כדי למדוד את זיקה מחייבת (למשל, קבוע דיסוציאציה Kd), אבל זה לא למדוד את קינטיקה של האיגוד, ולא ניתן להחיל אותה כאשר Kd נמוכה מאוד עקב לקוי יחס אות לרעש4. פלזמון משטח תהודה (SPR) ספקטרוסקופיה מכמת את קינטיקה מחייב, אך זה דורש על משטח ספציפי בטקטיקות של מגיבים אחד על פני השטח, אשר פוטנציאל תוכל לשנות את המאפיין איגוד של מגיב5. יתר על כן, קשה למדוד דיסוציאציה המחירים5וארגון מהר SPR, וזה לא ראוי לעשות שימוש SPR לאפיין את האירוע של החלפת החלבוניות בתוך קומפלקס החלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדידת שיעור של חלבונים מורכבים הרכבה ופירוק בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה. שיטה זו היתה חיונית לצורך קביעת התפקיד של Cullin – ssociated –Nedd8 –dissociated חלבון 1 (Cand1)כמו F-box חלבון exchange גורם6,7.
Cand1 מסדיר את הדינמיקה של Skp1•Cul1•F-תיבת חלבון (SCF) E3 ligases, אשר שייכת למשפחה גדולה של Cullin-טבעת אוביקוויטין ligases. SCFs מורכב cullin Cul1, אשר נקשר החלבון תחום טבעת Rbx1, ולא של חלבון F-box להחלפה, אשר מגייס סובסטרטים ומאגד Cul1 דרך החלבון מתאם Skp18. E3 ליגאז, SCF מזרז את ההטיה של אוביקוויטין את המצע שלה, וגם זה מופעל כאשר המצע הוא גויס על ידי החלבון F-box, וכאשר Cul1 משתנה על ידי החלבון אוביקוויטין דמוי Nedd89. Cand1 נקשר Cul1 שלא שונתה, על הכריכה, זה משבש גם איגוד חלבון Skp1•F-box עם Cul1 וגם את ההטיה של Nedd8 Cul110,11,12,13. כתוצאה מכך, Cand1 שנראה מעכב פעילות SCF במבחנה, אבל חוסר Cand1 אורגניזמים גרם פגמים שמרמז תפקיד חיובי של Cand1 בוויסות פעילות SCF vivo14,15,16 , 17. פרדוקס זה הוסבר בסופו של דבר על ידי מחקר כמותי שגילה את האינטראקציות דינמי בין חלבון Cul1, Cand1 ו Skp1•F-box. באמצעות קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג) מבחני המאתרות את היווצרות מתחמי SCF ו- Cul1•Cand1, שיוך של דיסוציאציה לדרג קבועים (k– ו kחופש, בהתאמה) היו נמדד בנפרד. המדידות חשפו כי הן Cand1 והן Skp1•F-תיבת חלבון טופס הדוק ביותר מתחם עם Cul1, אבל את kהנחה של SCF מתגברת באופן דרמטי על ידי Cand1, kהנחה של Cul1•Cand1 הוא גדלו דרמטית. על ידי Skp1•F-תיבת חלבון6,7. תוצאות אלה מספקים את התמיכה הראשונית וקריטיים להגדרת תפקידו של Cand1 כגורם exchange חלבון, אשר מזרז היווצרות של מתחמי SCF חדש באמצעות מיחזור Cul1 מ מתחמי SCF הישן.
כאן, אנו מציגים את ההליך של פיתוח ושימוש וזמינותו סריג ללמוד את הדינמיקה של מורכבות Cul1•Cand17, ניתן להחיל את אותו עיקרון ללמוד את הדינמיקה של מולקולות שונות. סריג מתרחשת כאשר תורם הוא מתרגש עם הגל המתאים, מקבל עם ספקטרום עירור חפיפה ספקטרום הפליטה תורם קיים למרחק של 10-100 Å. המדינה נרגשת מועבר מקבל, ובכך להקטין את עוצמת התורם, הגדלת עוצמת מקבל18. היעילות של קשת/קשתית (E) תלוי רדיוס פורסטר (R0) והן את המרחק בין התורם ואת מקבל fluorophores (r), מוגדר על-ידי: E = R06/ (R0 6 + r6). רדיוס פורסטר (R0) תלויה במספר גורמים, כולל כיוון זוויתי דיפול, החפיפה ספקטרלי של הזוג מקבל התורם, והפתרון היה19. למרוח וזמינותו סריג fluorimeter עצר-flow, אשר מפקח על השינוי של הפליטה תורם בזמן אמת ומאפשר מדידות של מהיר k– ו kאת, זה הכרחי ליצור סריג יעיל זה תוצאות לירידה משמעותית של פליטת התורם. לכן, עיצוב סריג יעיל על-ידי בחירת הזוג המתאים של צבעי פלורסנט, ואתרים על החלבונים היעד כדי לצרף את צבע חשוב, יידונו ב פרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סריג הוא תופעה פיזיקלית זה עניין רב בלימוד והבנה של מערכות ביולוגיות19. כאן, אנו מציגים עבור בדיקה ושימוש סריג ללמוד את איגוד קינטיקה של שני חלבונים שמעצבת פרוטוקול. בעת עיצוב סריג, שקלנו שלושה גורמים עיקריים: ספקטרלי החפיפה בין התורם פליטה, מקבל עירור, המרחק בין את fluorophores שני, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שן שו-Ou (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) לדיון תובנה על התפתחות וזמינותו סריג. מ. ג, Y.Z. ו- X.L. במימון קרנות הפעלה מאוניברסיטת Purdue כדי Y.Z., X.L.This עבודה נתמך בחלקו על ידי מענק זרע מן המרכז של אוניברסיטת Purdue עבור ביולוגית הצמח.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
References
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
- Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
- Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
- Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
- Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
- Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
- Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
- Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
- Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
- Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
- Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
- Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
- Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
- Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
- Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
- Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
- Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
- Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
- Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
- Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
- Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
- Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
- Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
- Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
- Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).
